Цитология, 2020, T. 62, № 7, стр. 487-492

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клетки. Мезенхимные стромальные клетки человека, полученные из десквамированного эндометрия (энМСК) и охарактеризованные в Институте цитологии РАН (Земелько и др., 2011), культивировали в полной культуральной среде (ПКС) на основе DMEM/F12 (Gibco, Великобритания), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Biowest, Франция), GlutaMAX (Gibco, Великобритания) и антибиотик/антимикотик (Capricorn, Германия) при 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Иммунофлуоресцентное мечение. Для иммунофлуоресцентного мечения энМСК сеяли на покровные стекла с плотностью 10 тыс. клеток/см². На следующие сутки среду заменяли на ПКС, либо на ПКС, содержащую 10 нМ ЭФР (Molecular Probes, США). В этих средах клетки культивировали в течение указанного времени, после чего фиксировали формальдегидом в концентрации 3.6% (Sigma-Aldrich, США), приготовленным на PBS, в течение 15 мин. Далее все растворы готовили на основе PBS. После фиксации клетки промывали PBS и пермеабилизовали Brij56 в концентрации 0.05% (Sigma-Aldrich, США) 15 мин с последующими отмывками. Затем неспецифическое мечение блокировали с помощью 1%-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА), в котором также разводили антитела: моноклональные антитела мыши против CD146 (клон P1H12, Cell Signaling (CS), Нидерланды, кат. № 13475) в разведении 1 : 50, поликлональные антитела кролика против рЭФР (CS, кат. № 4267), Rab5 (CS, кат. № 3547) или Rab11 (CS, кат. № 5589) в разведении 1 : 100. Клетки инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°C. С вторичными антителами козы против антител мыши и кролика, конъюгированными с Alexa-488 и Alexa-568 соответственно (Molecular Probes, США), в разведении 1 : 200 и с добавлением Hoechst33342 в концентрации 1 мкг/мл (Molecular Probes, США) энМСК инкубировали 15 мин при 37°C. Затем клетки промывали PBS. Готовые препараты заключали в глицериновую среду, содержащую 1% DABCO (Sigma-Aldrich, США).

Конфокальная микроскопия. Микроскопические изображения получали с помощью конфокального микроскопа Olympus FLUOVIEW 3000 (Olympus, Япония) c объективом 40×/1.3 с масляной иммерсией. Для возбуждения флуоресценции использовали диодные источники света с длинами волн 405, 488 и 561 нм. Для регистрации флуоресценции в разных каналах использовали режим последовательного сканирования. Мощность лазеров и напряжение на детекторах оставались неизменными в течение эксперимента. “Стопки” изображений размером 1024 × × 1024 пикселей получали в режиме xyz с шагом в 500 нм по оси z.

Анализ изображений. Изображения анализировали в программе Fiji на базе ImageJ 1.52p (Schindelin et al., 2012). Для сегментации везикул использовали метод вычитания из исходного изображения картинки, полученной с помощью медианного фильтра с экспериментально подобранным радиусом 10 пикселей (Dunn et al., 2011). Такая манипуляция позволяет увеличить разницу интенсивности пикселей между краем везикулы и прилежащей областью, что способствует более точной сегментации. Полученные в результате сегментации на проекциях максимальной яркости контуры везикул переносили на исходное изображение для оценки интенсивности флуоресценции везикул. Для оценки интенсивности флуоресценции контуры клеток выделяли на проекциях максимальной яркости вручную. Для оценки колокализации везикул на оптическом срезе в базальной части клетки определяли долю частичного совпадения контуров везикул одного канала с масками везикул другого канала.

Анализ данных. Полученные данные анализировали в программе RStudio (RStudio, США). Все эксперименты были повторены как минимум 3 раза, на иллюстрациях представлен репрезентативный эксперимент. В каждом эксперименте анализировали не менее 10–15 клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мы обнаружили, что, в энМСК CD146 располагается не только на плазматической мембране, но и во внутриклеточных везикулах (рис. 1а, 2а). Подобная картина описана для других молекул клеточной адгезии иммуноглобулинового суперсемейства, например, для PECAM-1 (Mammadzada et al., 2016). В среднем 33.5 ± 1.2% этих везикул колокализуется с маркером ранних эндосом Rab5 и 38.4 ± 1.7% – с маркером околоядерного рециклирующего компартмента Rab11 (рис. 1б), но часть везикул не колокализуется с этими маркерами. Транспорт через Rab11⁺ компартмент описан для многих молекул клеточной адгезии и играет регуляторную роль в миграции, взаимодействии клетки с матриксом, эпителиально-мезенхимальном переходе и установлении клеточной полярности (Nishimura, Sasaki, 2008). Природа везикул, не содержащих исследованные Rab-белки, нам неизвестна.

Рис. 1.

Колокализация внутриклеточного CD146 с маркерами рециклирующих и ранних эндосом. а – энМСК, меченые антителами против CD146 (зеленый) и Rab11, либо Rab5 (красный), стрелками отмечены колокализующиеся везикулы. Масштабный отрезок на основных изображениях – 10 мкм, на врезках – 5 мкм. б – Результаты количественной оценки колокализации CD146 с Rab-белками представлены в виде графика типа “boxplot”, где отражены минимальное и максимальное значения, верхний и нижний квартили и медиана.

Под действием ЭФР происходит быстрая интернализация рЭФР в течение 15 мин с формированием в среднем 251 ± 44 везикул, но количество CD146⁺ везикул за то же время не увеличивается (рис. 2б). При этом около 25% рЭФР⁺ везикул колокализуется с CD146 (рис. 2в). Оценка скорости интернализации CD146 с помощью антител, конъюгированных с флуорохромом (Nollet et al., 2017), показала, что заметное количество CD146⁺ эндосом появляется лишь в течение 3 ч. Можно предположить, что интернализация CD146 и рЭФР происходит с помощью разных механизмов, хотя их колокализация может свидетельствовать как о неспецифичеком включении CD146 в рЭФР⁺ окаймленные ямки на мембране, так и о пересечении их путей в процессе слияний эндосом.

Рис. 2.

Внутриклеточная локализация CD146 в ходе эндоцитоза рЭФР. а – Эндоцитоз в энМСК был стимулирован добавлением ЭФР (10 нМ), затем клетки были зафиксированы в указанное время и помечены антителами против CD146 (зеленый) и рЭФР (красный), масштабный отрезок – 10 мкм; б – результаты оценки количества везикул, в – результаты количественной оценки колокализации CD146 с рЭФР. На графиках данные представлены в виде графика типа “boxplot”, где отражены минимальное и максимальное значения, верхний и нижний и медиана.

Полученные нами ранее данные указывали на снижение количества CD146 лишь на поверхности клеток в ходе длительного (5 сут) культивирования в среде, содержащей ЭФР. За это время клетки формируют плотный монослой. С помощью иммунофлуоресцентного анализа мы обнаружили, что снижается общее количество CD146 в клетке, в том числе и в везикулах, и это происходит во всей популяции энМСК (рис. 3). Кроме того, снижается и общая интенсивность флуоресценции рЭФР. Интересно, что на клетках эндотелия показано, что количество CD146 на поверхности клетки увеличивается при формировании монослоя (Bardin et al., 2001), тогда как в энМСК мы наблюдаем противоположный эффект. Вероятно, существуют тканеспецифические механизмы регуляции экспрессии CD146.

Рис. 3.

Интенсивность флуоресцентного мечения, ассоциированного с CD146 и рЭФР, снижается в течение 5 сут культивирования в среде, содержащей ЭФР. а – энМСК культивировали в течение 5 сут в ПКС или в ПКС, содержащей 10 нМ ЭФР (ПКС+ЭФР), затем клетки были зафиксированы, помечены антителами против CD146 (зеленый) и рЭФР (красный) и окрашены Hoechst33342 (синий), масштабный отрезок – 50 мкм; на графиках представлена плотность распределения клеток по средней интенсивности флуоресцентного мечения целой клетки (б) или CD146⁺ везикул (в).

Таким образом, снижение количества CD146 при культивировании в среде, содержащей ЭФР, не связано с усилением интернализации CD146. Мы предполагаем, что CD146 и рЭФР, хоть и медленно, но деградируют в лизосомах в ходе культивирования с ЭФР, при том, что синтез новых молекул может быть подавлен.