Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2023, T. 40, № 3, стр. 194-202

ВВЕДЕНИЕ

Гипервозбуждение в нейрональных сетях головного мозга возникает вследствие травм или дегенеративных процессов и является ключевым патофизиологическим механизмом при некоторых неврологических заболеваниях, таких как эпилепсия, начальная стадия инсульта, болезнь Альцгеймера [1, 2]. Длительное гипервозбуждение может быть причиной повреждения и гибели отдельных популяций нейронов в мозге [3]. На сегодняшний день стратегия лечения многих нейродегенеративных нарушений основана на снятии гипервозбуждения путем прямого подавления активности опосредующих возбуждение нейронов ионных каналов и рецепторов. Эта стратегия не всегда работает успешно, поскольку некоторые пациенты с неврологическими расстройствами невосприимчивы к традиционному медикаментозному лечению, что требует разработки нового более селективного неинвазивного терапевтического подхода [4, 5]. Альтернативными кандидатами для использования в качестве терапевтических соединений рассматриваются агонисты каннабиноидных (CB) рецепторов.

Каннабиноидные рецепторы представляют собой класс сопряженных с G_i-белками рецепторов, которые опосредуют биологические эффекты фитоканнабиноидов, эндоканнабиноидов и синтетических каннабимиметических соединений [6]. Рецепторы этого семейства широко распространены в организме человека и их разделяют на два типа: CB₁-рецепторы и CB₂-рецепторы. CB₁-рецепторы в основном экспрессируются в центральной нервной системе (ЦНС) [7]. Они привлекают к себе большое внимание, поскольку участвуют в модуляции различных функций мозга, включая формирование памяти и эмоционального компонента поведения, либо посредством прямого воздействия продуктов эндоканнабиноидной системы, либо через воздействие на глутаматергическую, ГАМКергическую и дофаминергическую системы. Нокаут гена СВ₁-рецептора у мышей вызывает спонтанные судороги и оказывает проконвульсантный эффект в каинатной и пилокарпиновой моделях эпилепсии [8, 9]. Ранее считалось, что в отличие от CB₁-рецептора, CB₂-рецепторы преимущественно экспрессируются в тканях/органах иммунной системы, таких как селезенка, миндалина, тимус и лимфоидные ткани [10]. Однако при определенных заболеваниях CB₂-рецепторы индуцибельно экспрессируются в ЦНС. Вначале было показано, что при нейродегенеративных расстройствах, например, при болезни Гентингтона, экспрессия CB₂-рецепторов в головном мозге значительно повышается [11]. Затем функциональные CB₂-рецепторы были обнаружены во всей ЦНС. СВ₂-рецепторы в основном локализованы постсинаптически, и их активация приводит к гиперполяризации нейронов и, следовательно, к снижению возбудимости [12–15].

Доказано, что каннабиноиды обладают противосудорожными свойствами [16]. CB₁-рецепторы могут модулировать нейротрансмиссию, подавляя высвобождение ГАМК и глутамата из пресинаптических терминалей. Этот ретроградный процесс был предложен в качестве основного механизма нейропротекторного действия эндогенных каннабиноидов против глутаматной эксайтотоксичности ‒ патологического процесса, характерного для многих неврологических расстройств, включая эпилепсию и нейродегенеративные заболевания [7, 17–19]. Несмотря на многочисленные публикации, демонстрирующие участие СВ-рецепторов в защите мозга от гипервозбуждения, полное понимание механизмов противоэпилептического действия каннабиноидов отсутствует. Проблема состоит не только в том, что известны не все эндогенные каннабиноиды (ECBs), рецепторы и ферменты (фосфодиэстеразы), производящие ECBs, но и в том, что СВ-рецепторы мозга могут быть локализованы в разных типах тормозных [20] и возбуждающих [21] нейронов как пресинаптически, так и постсинаптически. СВ-рецепторы нейронов сопряжены с G_i/o‑белками, мишенями которых являются аденилатциклаза, потенциал-зависимые кальциевые и калиевые каналы. В зависимости от локализации рецептора, тормозной потенциал их активаторов будет преимущественно реализовываться либо через уменьшение концентрации Са²⁺, либо через изменение электрического потенциала. Также стоит отметить, что СВ-рецепторы обнаружены и на астроцитах, где они активируют каскад кальциевой сигнализации с участием фосфолипазы С [22]. Показано, что кальциевый сигнал в астроцитах вызывает секрецию глутамата, ГАМК, ATP [23, 24], которые модулируют функциональную активность нейронов.

На сегодняшний день синтезировано большое количество агонистов каннабиноидных рецепторов, в том числе и полных агонистов (активируют CB₁- и CB₂-рецепторы), таких как WIN 55,212, mAEA, HU210 и другие, однако их применение в качестве лекарственных средств все еще ограничено, что объясняется не только до конца неизученными молекулярными механизмами, но и наркогенным потенциалом, способностью нарушать когнитивные функции, в том числе кратковременную память, а также сравнительно быстрым развитием толерантности в отношении их наиболее важных эффектов [25]. К тому же известные агонисты СВ-рецепторов не обладают специфичностью в отношении отделов головного мозга. Данная работа посвящена изучению эффектов наиболее часто используемого в исследованиях и демонстрирующего умеренную селективность по отношению к CB₁-рецепторам агониста каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 на индуцированные осцилляции внутриклеточной концентрации Ca²⁺ в различных клеточных моделях эпилептиформной активности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все эксперименты в данном исследовании были проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

Приготовление культуры клеток. В экспериментах использовались смешанные культуры клеток гиппокампа, выделенные из головного мозга новорожденных крыс линии Wistar (1–3 дневного возраста). Извлеченный после декапитации гиппокамп помещали в холодный раствор Версена, не содержащий ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, и измельчали ножницами. Для ферментативной деградации фрагментов ткани, измельченный биоматериал инкубировали с добавлением 1% раствора трипсина в течение 10 мин при 37°C при постоянном перемешивании на шейкере (600 об/мин). После этого ткань отмывали холодной средой Neurobasal-A для инактивации трипсина. Затем фрагменты ткани осторожно пипетировали, а крупные неизмельченные фрагменты осторожно удаляли. Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 3 мин при 500g и удаляли супернатант. Клетки ресуспендировали в среде Neurobasal-A с добавлением бессывороточного суплемента B-27 (2%), глутамина (0.5 мМ), пенициллина-стрептомицина (1 : 100). После этого клетки высевали на круглые покровные стекла диаметром 25 мм, предварительно покрытые полиэтиленимином и помещенные в стерильные чашки Петри диаметром 35 мм. Клетки культивировали при 37°C в CO₂-инкубаторе в среде с содержанием 5% CO₂ и влажности 95%. Одну треть объема среды для культивирования клеток заменяли свежей средой каждые 3–4 дня. В экспериментах использовали культуры клеток в возрасте 13–14 дней in vitro (DIV).

Флуоресцентная визуализация изменений [Ca²⁺]_i. Для регистрации изменений [Ca²⁺]_i в клетках гиппокампа использовали ратиометрический Са²⁺-чувствительный зонд Fura-2. Клетки загружали зондом (5 мкМ), растворенным в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS), содержащем (в мМ): 156 NaCl, 3 KCl, 2 MgSO₄, 1.25 KH₂PO₄, 1.5 CaCl₂, 10 глюкозы, 10 HEPES, рН 7.35. Культуру клеток инкубировали с зондом в течение 40 мин при 37°C с последующей отмывкой. Для визуализации флуоресценции Fura-2 использовали моторизованный инвертированный микроскоп Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Германия) с объективом HC PL APO 20×/0.7 IMM. Микроскоп был оснащен высокоскоростной монохромной CCD-камерой Hamamatsu C9100 и системой быстрой замены фильтров возбуждения Leica’s Ultra-Fast Filter Wheels (период переключения 10–30 мс), которая позволяет обнаруживать быстрые изменения [Ca²⁺]_i. В качестве источника возбуждения использовался осветитель Leica EL6000 с ртутной лампой высокого давления HBO 103 W/2. Возбуждение и регистрацию флуоресценции Fura-2 осуществляли с помощью набора фильтров FU2 (Leica Microsystems) с фильтрами возбуждения BP340/30 и BP387/15, светоделителем FT410 и фильтром эмиссии BP510/84. Изменения [Ca²⁺]_i представлены в виде соотношения 340/387, полученного из покадровых серий изображений после вычитания фона. N – количество клеток, проанализированных в каждом индивидуальном эксперименте, n – количество независимых повторов.

Индукция колебаний [Ca²⁺]_i в нейронах. В работе использовали две модели индукции регулярных высокоамплитудных колебаний [Ca²⁺]_i (кальциевых колебаний) в нейронах для изучения влияния агониста каннабиноидных рецепторов на активность нейрональных сетей. Первая модель предполагает использование конкурентного антагониста ГАМК(А)-рецепторов, бикукуллина (10 мкМ). Блокирование ГАМК(А)-рецепторов приводит к гипервозбуждению нейрональных сетей. Вторая модель основана на использовании высоких доз ионов аммония. Аммоний (NH₃/${\text{NH}}_{4}^{ + }$) является токсичным веществом и его концентрация в головном мозге может повышаться до 5 мМ при дисфункции печени [26]. Кроме того, концентрация аммония может достигать 16 мМ при абсцессах головного мозга [27]. В предыдущей работе мы показали, что концентрация 8 мМ хлорида аммония (NH₄Cl) может вызывать высокочастотные кальциевые колебания в нейронах [28]. Исходя из этого, мы использовали эту концентрацию в наших экспериментах для получения регулярных кальциевых колебаний.

Иммуноцитохимическое окрашивание. Для идентификации астроцитов использовали иммуноцитохимический метод. Поскольку измерения [Ca²⁺]_i и регистрацию флуоресценции антител проводили на разных микроскопах, то для совмещения изображений на обратную сторону круглого покровного стекла с культурой клеток тонким маркером наносили сетку с шагом 2 мм. В обоих микроскопах изображение сетки совмещалось с изображением перекрестия окуляра. После регистрации кальциевого сигнала клетки фотографировали в режиме фазово-контрастной микроскопии и каждую клетку нумеровали. Затем клетки фиксировали и анализировали иммуноцитохимически с использованием антител против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 мин и трижды промывали ледяным PBS в течение 5 мин. Для пермеабилизации клетки обрабатывали 0.1% раствором Тритона X-100 в течение 15 мин. Для блокирования неспецифических сайтов связывания антител фиксированные клетки инкубировали в 10% сыворотке козы в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали с первичными антителами мыши против GFAP в течение 12 ч при 4°C (1 : 200 в 1% сыворотке козы). Фиксированные клетки затем промывали PBS (3 раза в течение 5 мин) и обрабатывали вторичными антителами козы против антител мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 647 (1 : 200 в PBS) в соответствии с руководством производителя (Abcam, Великобритания). Для окрашивания ДНК в фиксированных клетках использовали ДНК-специфический флуоресцентный зонд Hoechst 33 342. Флуоресценцию антител регистрировали с помощью инвертированного конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Германия) при возбуждении HeNe-лазером с длиной волны возбуждения 633 нм и регистрации при 655–700 нм.

Реагенты. В экспериментах использовались следующие реагенты: NaCl, KCl, MgSO₄, KH₂PO₄, CaCl₂, глюкоза, полиэтиленимин, пенициллин-стрептомицин, глутамин, хлорид аммония (Sigma-Aldrich, США); среда Neurobasal-A, суплемент B-27, трипсин (1%), сыворотка козы (Life Technologies, США); Fura-2 AM, Hoechst 33 342 (Molecular Probes, США); (−)-Bicuculline methochloride, WIN 55,212-2, PF 514 273 (Tocris Bioscience, Великобритания); HEPES (Диаэм, Россия); антитело мыши к GFAP, антитело козы к антителам мыши (Alexa Fluor 647, Abcam, Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как отмечено выше, для исследования нейропротекторных свойств агониста СВ-рецепторов WIN 55,212-2 в данной работе использовались модели гипервозбуждения, индуцированного бикукуллином и высокими дозами хлорида аммония. Концентрация бикукуллина во всех сериях экспериментов составляла 10 мкМ, а аммония (NH₄Cl) 8 мМ, так как оба соединения в этих концентрациях могут вызывать регулярные кальциевые колебания на определенной стадии развития нейрональной сети. Однако концентрация аммония 8 мМ считается относительно высокой и может вызывать побочные эффекты, в том числе сдвиг значения рН внутриклеточной среды в кислую сторону. Чтобы свести к минимуму влияние изменений pH, добавление WIN 55,212-2 проводили через 3 мин после добавления аммония, так как после этого временнóго интервала значения внутриклеточного pH выходят на стационарный уровень [29].

На рис. 1 показано, что бикукуллин вызывает кальциевые колебания, а добавление в среду WIN 55,212-2 в концентрации от 100 нМ и выше заметно подавляет эти колебания. Полное подавление индуцированных бикукуллином осцилляций [Ca²⁺]_i в случае бикукуллина наблюдалось при концентрации WIN 55,212-2 ≥ 1 мкМ. В свою очередь антагонист каннабиноидных CB₁-рецепторов PF 514 273 (значения K_i 1 и >10 000 нМ для CB₁- и CB₂-рецепторов соответственно) отменял действие WIN 55,212-2, демонстрируя, что эффект подавления осцилляций был обусловлен активацией CB₁-рецепторов.

Рис. 1.

а – Влияние агониста каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 (1 мкМ) на индуцированные бикукуллином (10 мкМ) осцилляции внутриклеточной концентрации Ca²⁺ в нейронах (красные кривые). (N = 100, n = 4). б –Антагонист CB₁-рецепторов PF 514273 (500 нМ) отменяет действие WIN 55,212-2 (1 мкМ) на индуцированные бикукуллином кальциевые осцилляции. (N = 100, n = 4). Зеленые кривые – не отвечающие на аппликацию бикукуллина глиальные клетки.

Из рис. 2а видно, что добавление хлорида аммония также индуцировало высокочастотные кальциевые колебания и увеличение базальной [Ca²⁺]_i в нейронах. Кроме того, небольшое повышение [Ca²⁺]_i наблюдалось в группе клеток, которые методом иммуноцитохимического окрашивания были идентифицированы как астроциты (рис. 2а, зеленые стрелки; рис. 2б, белые стрелки). Следует отметить, что добавление в среду WIN 55,212-2 в концентрации ≥2 мкМ на фоне хлорида аммония вызывало подавление кальциевых колебаний во всех нейронах, в то время как в астроцитах (приблизительно 20% всех GFAP-позитивных клеток в культуре) наблюдалось бифазное повышение базального уровня [Ca²⁺]_i.

Рис. 2.

а – Аппликация WIN 55,212-2 (2 мкМ) подавляет индуцированные хлоридом аммония осцилляции [Ca²⁺]_i и вызывает импульсное увеличение [Ca²⁺]_i в астроцитах (N = 100, n = 5). б – Иммуноцитохимическое окрашивание клеточных культур антителами к селективному маркеру астроцитов, глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP). Стрелками указаны астроциты, изменения [Ca²⁺]_i в которых показаны на панели а. Для окрашивания ядер клеток использовали краситель Hoechst 33342. в – Аппликация WIN 55,212-2 (2 мкМ) в отсутствие каких-либо воздействий (N = 100, n = 3). г – Частичная отмена активирующего действия антагониста CB₁-рецепторов PF 514273 (500 нМ) агонистом СВ₁- и СВ₂-рецепторов WIN 55,212-2 (2 мкМ). (N = 100, n = 3).

CB₁- и CB₂-рецепторы сопряжены с G_i-белком, альфа субъединица которого ингибирует аденилатциклазу и уменьшает продукцию cAMP [10, 19]. В свою очередь, как было показано ранее, в том числе и нами, бета-гамма субъединица G_i-сопряженных рецепторов может быть вовлечена в высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо при участии фосфолипазы C [30–33]. Активация этого сигнального каскада может объяснить бифазный ответ астроцитов на аппликацию WIN 55,212-2, представленный на рис. 2. Интересным является тот факт, что бифазный ответ наблюдается только в случае гипервозбуждения, индуцированного хлоридом аммония, тогда как в случае бикукуллина (рис. 1) и без каких либо воздействий (рис. 2в) астроциты не отвечают бифазным увеличением [Ca²⁺]_i на аппликацию WIN 55,212-2. Согласно устоявшейся концепции, в условиях острой гипераммониемии аммоний проникает в клетки в первые секунды воздействия в виде молекулы аммиака (NH₃) [34], достаточно легко проходящей через липидный бислой цитоплазматической мембраны. По причине того что молекулы аммиака являются акцепторами протонов, их быстрое накопление в клетках должно сопровождаться резким повышением внутриклеточного pH. Ранее в экспериментах с острой гипераммониемией мы продемонстрировали кратковременное защелачивание внутриклеточной среды, которое затем сменялось значительным длительным закислением [29]. Причиной закисления является медленный вход ${\text{NH}}_{4}^{ + }$ через ионные каналы и транспортеры. Ионы аммония, в свою очередь, являются донорами протонов, которые, высвобождаясь при диссоциации, приводят к понижению pH. Как показали наши эксперименты, закисление внутриклеточной среды в условиях гипераммониемии происходит уже через 2–3 мин воздействия аммония [29]. Добавление WIN 55,212-2 происходило спустя 3 мин воздействия хлорида аммония. Следовательно, можно предположить, что ответ астроцитов на WIN 55,212-2 в условиях гипераммониемии и его отсутствие в экспериментах без каких-либо дополнительных воздействий связано с изменениями внутриклеточного pH. Следует отметить, что для сопряженных с G-белками рецепторов показана pH-чувствительность и зависимость активируемого сигнального каскада от pH среды [35, 36]. Этот факт может свидетельствовать в пользу выдвинутого предположения.

Астроциты передают информацию, полученную от соседних клеток ЦНС, и генерируют сигналы на локальном или сетевом уровне с помощью Ca²⁺-зависимой секреции глионейротрансмиттеров [23, 37]. Кальциевые импульсы и волны в астроцитах рассматриваются в качестве основного способа передачи сигналов внутри астроцитарного синцития. Однако механизмы и последствия астроцитарной Ca²⁺-сигнализации все еще недостаточно изучены. Эндоканнабиноиды, активируя внутриклеточные Ca²⁺-сигнальные каскады, вовлекают астроциты в модуляцию синаптической пластичности [38]. Ранее увеличение [Ca²⁺]_i в астроцитах в ответ на добавление WIN 55,212-2 было показано для астроцитов супрахиазматического ядра. Этот эффект, как сообщают авторы, опосредован активацией CB₁-рецепторов [39]. Повышение внутриклеточной концентрации Ca²⁺ в астроцитах может приводить к секреции различных глиотрансмиттеров, включая глутамат, ATP и ГАМК [23]. Как было показано ранее, Ca²⁺-зависимая секреция ГАМК астроцитами может объяснить подавление агонистами α₂-адренергических рецепторов индуцированных аммонием колебаний [30]. Можно предположить, что подавление колебаний WIN 55,212-2 (рис. 2) также происходит за счет ГАМК, секретируемого астроцитами. Однако ингибирующее действие WIN 55,212-2 связано не только с астроцитами. Подавление колебаний, индуцированных бикукуллином, по всей видимости, связано с действием WIN 55,212-2 на нейрональные рецепторы.

Чтобы выявить возможное участие CB₂-рецепторов в регуляции активности нейрональной сети при действии хлорида аммония, агонист СВ₁-/СВ₂-рецепторов WIN 55,212-2 добавляли на фоне селективного антагониста CB₁-рецепторов PF 514 273. PF 514 273 в избыточной концентрации ≥200 нМ, существенно увеличивал частоту осцилляций [Ca²⁺]_i и повышал базальный уровень [Ca²⁺]_i (рис. 2г), что указывает на резидентную роль CB₁-рецепторов в торможении сети нейронов при аппликации хлорида аммония. Концентрация 200 нМ также в 50 раз меньше его K_i к CB₂-рецептору, что практически исключает воздействие на этот рецептор. Дальнейшая аппликация WIN 55,212-2 (2 мкМ) привела к уменьшению частоты осцилляций [Ca²⁺]_i и понижению базального уровня [Ca²⁺]_i. В сумме эти факты указывают на участие и CB₂-рецепторов в торможении активности сети нейронов при гипервозбуждении, индуцированном хлоридом аммония. Следует отметить, что активация СВ₂-рецепторов не прекращает колебания, но понижает уровень [Ca²⁺]_i.

Научные открытия в области исследования каннабиноидов продемонстрировали, что, действуя через СВ₁- и СВ₂-рецепторы, они облегчают симптомы, связанные с гипервозбуждением нейронов в сети. В моделях рассеянного склероза и болезни Гентингтона активация CB₁-рецепторов значительно снижала спазм и тремор, а экзогенное применение агониста каннабиноидных рецепторов 2-арахидоноилглицерина (2-AG) оказывало нейропротекторное действие после черепно-мозговой травмы [6, 7, 40]. Кроме того, в in vitro и in vivo исследованиях ишемии каннабиноиды значительно снижали эксайтотоксическую гибель нейрональных клеток, вызванную избыточной секрецией глутамата. Считается, что эти эффекты каннабиноидов связаны с подавлением секреции этого нейротрансмиттера за счет ингибирования активности пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов [41]. На молекулярном уровне противосудорожный механизм действия каннабиноидов все еще недостаточно изучен. Модуляция высвобождения нейротрансмиттеров за счет активации пресинаптических CB₁-рецепторов может рассматриваться в качестве одного из механизмов противосудорожных свойств каннабиноидов. Известно, что активация CB₁-рецептора уменьшает вход ионов кальция через N- и P/Q-типы Ca²⁺-каналов, результатом чего является снижение Са²⁺-зависимого высвобождения глутамата [42], при этом не исключается влияние на секрецию ГАМК. Хотя глутамат имеет ключевое значение для нормальной нейротрансмиссии, повышение его уровня в межклеточном пространстве приводит к эксайтотоксичности. Поэтому для снижения высвобождения данного нейромедиатора можно использовать каннабиноиды. Активация CB₁-рецептора также увеличивает проводимость пре- и постсинаптических K⁺-каналов [43]. Повышенная проницаемость K⁺-каналов приводит к снижению мембранного потенциала (гиперполяризации), что способствует подавлению эпилептиформной активности.

Было также показано, что активация CB₁-рецепторов в ГАМКергических нейронах ослабляет процессы торможения глутаматергических нейронов в гиппокампе за счет ретроградного действия эндогенных каннабиноидов, высвобождающихся при деполяризации последних. При этом происходит растормаживание постсинаптического нейрона и, следовательно, облегчение передачи возбуждения [44]. Кроме того, Cohen и коллеги продемонстрировали, что ГАМК, которая обычно является ингибирующим нейромедиатором, может в некоторых случаях усиливать возбуждение, синхронизуя аномальные разряды, возникающие при эпилепсии в срезах височной доли мозга человека [45]. Несмотря на то, что механизм этого явления не ясен, наиболее вероятное объяснение противосудорожного действия каннабиноидов при эпилепсии заключается в возможности CB₁-рецепторов вызывать компенсаторный сдвиг в балансе между ингибированием пресинаптического высвобождения глутамата и ГАМК.

Психоактивные побочные эффекты каннабиноидов усложняют их использование в лечении нейродегенеративных заболеваний, однако понимание молекулярных механизмов действия каннабиноидов может привести к разработке новых соединений, которые не влияют на поведенческую активность. Таким образом, дальнейшее исследование каннабиноидного противосудорожного феномена может пролить свет на новые терапевтические мишени для лечения различных нейродегенеративных нарушений, сопровождаемых гипервозбуждением, а также более четко определить физиологическую функцию, механизмы и сигнальные пути эндоканнабиноидной системы в головном мозге.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнялась в рамках государственного задания ИБК РАН, № 122041300005-4 “Функционирование рецепторов, ионных каналов и внутриклеточных сигнальных систем, механизмы межклеточных коммуникаций в различных типах клеток в норме и при патологиях. Поиск потенциальных мишеней для фармакотерапии”.

Соответствие принципам этики. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.