Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2023, T. 40, № 3, стр. 203-216

ВВЕДЕНИЕ

Липосомы являются широко известными невирусными системами доставки терапевтических молекул в живые клетки-мишени. Впервые о липосомах заговорили в 1960-е годы, после чего их стали широко применять для адресной доставки малых лекарственных молекул, белков, нуклеиновых кислот и др. как в фундаментальных исследованиях, так и в экспериментах in vitro и in vivo [1].

Существует несколько способов получения липосом. В зависимости от выбранной методики можно сформировать везикулы разных размеров и ламеллярности [2]. Размеры липосом могут составлять 20–200 нм (для мелких везикул), от 200 нм до 1 мкм (для крупных) и более 1 мкм (для гигантских везикул) [3]. Последние также могут существовать в виде многослойных везикул, состоящих из множества липидных бислоев. В медицинских целях наиболее часто применяют метод гидратирования тонкой липидной пленки с последующей обработкой ультразвуком для получения моноламеллярных везикул малого размера [4].

Коммерческие наборы липосом в основном состоят из различных типов синтетических амфифилов и фосфолипидов. Однако они могут быть нестабильными в средах, содержащих сыворотку, необходимую для роста клеток [5]. Например, общеизвестным реагентом для доставки нуклеиновых кислот (трансфекции) является Lipofectamine 2000 (Lf-2000). Комплексное исследование токсикологического влияния Lf-2000 на эукариотические клетки, в ходе которого клеточную линию HeLa обрабатывали различными концентрациями комплекса плазмидной ДНК (пДНК)/Lipofectamine 2000 в течение суток, показало гибель до 55% клеток HeLa [6].

Необходимость создания менее токсичных липосом для целей медицины привела к использованию химических подходов, которые позволяют смягчить нежелательные цитотоксические эффекты и увеличивают эффективность доставки терапевтических молекул в клетки [5]. Они включают варьирование структуры липидов, создание катионных и керасомообразующих липидов [7, 8], а также их комбинирование с фосфолипидами. Подобная стратегия является шагом на пути к более безопасной “Green Chemistry” [9]. Катионные липиды в составе липосом облегчают проникновение липосом внутрь клетки за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными липосомами и отрицательно заряженной поверхностью клеточных мембран [10]. Использование керасомообразующих липидов позволяет преодолеть низкую стабильность липосом – основной недостаток везикул на основе природных липидов [11]. Керасомообразующие липиды образуют на поверхности везикулы прочную сеть –Si–O–Si–, которая резко увеличивает устойчивость агрегатов по сравнению с обычными липосомами [12]. Введение в систему дополнительных липидов-хелперов (DOPE, DOPC, DPPC или холестерина) может увеличить эффективность липосом для решения конкретной задачи [13]. Для разных целей можно применять различные липиды, например, для увеличения эффективности трансфекции чаще всего используют DOPE [14–16], а для облегчения процесса проникновения в клетку – фосфатидилхолин [17].

Таким образом, целью данной работы было создание и изучение биологической активности смешанных липосом на основе катионных и керасомообразующих липидов, а также фосфолипидов как средств доставки противоопухолевых препаратов и нуклеиновых кислот. Амфифилы были синтезированы на основе природных L-аминокислот. Присутствие различных функциональных групп в аминокислотах дает возможность синтезировать большое разнообразие молекул для формирования липосомальных агрегатов различной морфологии [18–20]. Кроме того, природные L-аминокислоты могут способствовать биоразлагаемости молекул [21, 22]. В качестве катионных липидов были выбраны синтезированные нами ранее амфифилы на основе L-аланина и L-серина [23]. Для стабилизации транспортной системы была предложена оригинальная схема и синтезирован новый керасомообразующий липид на основе L-орнитина. В качестве фосфолипидов были выбраны фосфатидилхолин для доставки противоопухолевого препарата доксорубицина и DOPE для трансфекции. Исследованы физико-химические свойства смешанных липосом и изучена их биологическая активность в экспериментах in vitro. Результаты экспериментов показали перспективность использования средств доставки на основе L-серина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все химические вещества и реагенты коммерчески доступны и использовались без дополнительной очистки: Boc₂O (Sigma Aldrich), DCC (Sigma Aldrich), HOBt (Sigma Aldrich), L-орнитин моногидрохлорид (Sigma Aldrich), олеиламин (C₁₈H₃₅NH₂) (Sigma Aldrich), 3-(триэтоксисилил)пропилизоцианат (Sigma Aldrich), NaHCO₃ (Химмед, Россия), Na₂SO₄ безводный (Химмед, Россия), NaCl (Химмед, Россия), NaOH (Химмед, Россия), лимонная кислота (Химмед, Россия), TFA (Biochem, Франция), Triton X-100, DOPE (Avanti Polar Lipids, США), РС (Avanti Polar Lipids, США).

¹Н-ЯМР-спектры регистрировали в дейтерированном хлороформе (СDСl₃) на ЯМР-спектрометре “Bruker WM-300” с рабочей частотой 300 МГц. Внутренний стандарт – гексаметилдисилоксан. ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре “Bruker–EQUINOX 55”.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Сорбфил (Краснодар, Россия). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле Merck 0.040–0.063 мм (Германия). Обнаружение пятен веществ по ТСХ осуществляли нагреванием над пламенем спиртовки. Содержание двойной связи обнаруживали водным раствором KMnO₄. Вещества, содержащие свободную аминогруппу, обнаруживали 5%-ным раствором нингидрина с последующим нагреванием до 55–75°С.

N_α,N_δ-бис(трет-бутоксикарбонил)-L-орнитин (1). К раствору 1 г (5.92 ммоль) L-Orn·HCl в 10 мл 4 М водного раствора NaOH прикапывали в течение 1 ч раствор 5.18 г (23.7 ммоль) Boc₂O в 30 мл тетрагидрофурана, поддерживая рН 9–10 дополнительным количеством 4 М раствора NaOH, и перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре. Контроль реакции осуществляли по данным ТСХ в системе CHCl₃ : MeOH 1 : 1 (об/об). После окончания реакции растворитель удаляли в вакууме, вещество разбавляли водой, насыщали хлоридом натрия, подкисляли 10%-ным раствором лимонной кислоты до рН 3, экстрагировали этилацетатом и сушили над Na₂SO₄. Растворитель упаривали на роторном испарителе. Маслообразное вещество кристаллизовали гексаном. Получали 1.57 г (79.7%) продукта 1. R_f 0.85. ИК-спектр (KBr), ν/см^–1: 3354 (N-H, СОО-Н); 2975, 2933, 721 (C-H); 1697 (C=O, амид I); 1522 (N-C=O амид II); 1368, 1251 (C-O); 1171 (C-N).

N_α,N_δ-бис(трет-бутоксикарбонил)-L-орнитил-9-октадецениламид (2). К охлажденному до 0°С раствору 0.3 г (0.90 ммоль) соединения 1 в 4 мл безводного CH₂Cl₂ при перемешивании последовательно добавляли 0.24 г (1.8 ммоль) HOBt, раствор 0.37 г (1.8 ммоль) DCC в 5 мл безводного CH₂Cl₂ и 0.36 г (1.4 ммоль) олеиламина в 5 мл безводного CH₂Cl₂. Смесь выдерживали при интенсивном перемешивании в течение 24 ч. Контроль протекания реакции осуществляли по данным ТСХ в системе CHCl₃ : MeOH 20 : 1 (об/об). После завершения реакции выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровали. Продукт выделяли колоночной хроматографией в системе CCl₄ : MeOH 10 : 1 (об/об). Получали 0.52 г (99.4%) соединения 2. R_f 0,86 (CHCl₃ : MeOH 9 : 1 (об/об)). ¹Н-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 0.82 (т, 3 Н, CH₂СН₃); 1.22 (м, 22 Н, СН₂); 1.24 (м, 2 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 1.37 (c, 18 H, CCH₃); 1.50 (м, 2 Н, С(О)NHСН₂СН₂); 1.69 (м, 2 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 1.90 (д.д., 4 H, CH₂CH= =CHCH₂); 3.02 (м, 2 H, CHCH₂CH₂CH₂); 3.15 (м, 2 Н, С(О)NHСН₂СН₂); 4.16 (с, 1 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 4.91 (т, 1 H, δ-NH); 5.28 (т.д., 2 H, CH₂CH=CHCH₂, J = 6.1, 5.5, 3.3); 5.41 (д, 1 H, α-NH); 6.75 (с, 1 H, C(O)NH).

L-орнитил-9-октадецениламид (3). К охлажденному до 0°С 0.52 г (0.89 ммоль) соединения 2 в 20 мл безводного CH₂Cl₂ добавляли раствор 20 мл TFA в CH₂Cl₂ (1 : 1 об/об) и перемешивали в течение 1 ч при 0°С. За ходом реакции следили по данным ТСХ в системе CHCl₃ : MeOH 9 : 1 (об/об). После завершения реакции растворитель с TFA отгоняли в вакууме с получением трифторацетатной соли в виде масла. Далее технический продукт растворяли в 30 мл CHCl₃, последовательно промывали 10%-ным NaHCO₃ (3 × 30 мл) и водой до рН 7, сушили над Na₂SO₄, растворитель отгоняли на роторном испарителе. Выход продукта 3 составил 0.33 г (96.0%). R_f 0.09 (CHCl₃ : : MeOH 9 : 1 (об/об)). ¹Н-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 0.87 (т, 3 Н, CH₂СН₃); 1.25 (м, 22 Н, СН₂); 1.50 (м, 2 Н, С(О)NHСН₂СН₂); 1.70 (м, 4 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 1.99 (д.д., 4 H, CH₂CH=CHCH₂); 2.73 (т, 1 H, C(O)NH); 3.22 (т, 2 Н, С(О)NHСН₂СН₂); 3.42 (м, 2 H, CHCH₂CH₂CH₂); 4.12 (д, 1 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 5.34 (т.д., 2 H, CH₂CH=CHCH₂, J = 6.2, 5.5, 3.4); 7.20 (д, 2 H, α-NH); 8.12 (т, 2 H, δ-NH).

N_α,N_δ-бис-[(3-триэтоксисилил)пропилизоцианат]- L-орнитил-9-октадецениламид (4). К раствору 0.3 г (0.79 ммоль) соединения 3 в 25 мл безводного CH₂Cl₂ добавляли по каплям в течение 30 мин при перемешивании 0.43 г (1.73 ммоль) (3-триэтоксисилил)пропилизоцианата. Смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Контроль реакции осуществляли по данным ТСХ в системе CHCl₃ : MeOH 20 : 1 (об/об). После окончания реакции растворитель упаривали, технический продукт последовательно промывали метанолом (1 × 10 мл) и гексаном (2 × 10 мл). Продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии в системе CCl₄ : MeOH 25 : 1 (об/об). Получали 0.93 г (91.0%) вещества 4. R_f 0.47 (CHCl₃ : MeOH 20 : 1 (об/об)). ¹Н-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 0.62 (т, 4 Н, CH₂CH₂CH₂Si); 0.87 (т, 3 Н, CH₂СН₃); 1.19-1.36 (м, 40 Н, СН₂СН₃, OCH₂CH₃); 1.56 (м, 2 Н, С(О)NHСН₂СН₂); 1.61 (м, 2 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 1.64 (м, 4 Н, CH₂CH₂CH₂Si); 1.71 (м, 2 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 1.94 (м, 4 H, CH₂CH=CHCH₂); 3.14 (м, 2 Н, С(О)NHСН₂СН₂); 3.18 (м, 2 H, CHCH₂CH₂CH₂); 3.47 (с, 2 Н, α-NHС(О)NH); 3.54 (с, 2 Н, δ-NHС(О)NH); 3.65 (с, 4 Н, CH₂CH₂CH₂Si); 3.80–3.82 (м, 12 Н, OCH₂CH₃); 4.14 (д, 1 Н, CHCH₂CH₂CH₂); 4.91 (с, 1 H, C(O)NH); 5.33 (м, 2 H, CH₂CH=CHCH₂).

Приготовление липосомальных дисперсий. Навеску липидов, достаточную для создания концентрации 2 мг/мл, растворяли в 2 мл хлороформа и упаривали на роторном испарителе при 30 об/мин и температуре 35°С до образования тонкой пленки. Пленку сушили в вакууме в течение 3–4 ч и затем гидратировали дистиллированной водой в течение 30 мин при медленном перемешивании. Смоченную пленку обрабатывали ультразвуком в течение 50 мин при температуре 40°С.

Средний размер частиц и дзета-потенциал. Распределение частиц по размерам оценивали методом фотонно-корреляционной спектроскопии, основанным на принципах динамического светорассеяния. При определении дзета-потенциала раствор разбавляли водой при 25°С. Измерения проводили на приборе типа “Zetasizer Nano ZS” (Malvern Panalytical, UK).

Стабильность при хранении. Стабильность липосомальных дисперсий при хранении при комнатной температуре оценивали по изменению значений показателя оптической плотности при длине световой волны 400 нм в течение двух-трех недель. В качестве контроля использовали дистиллированную воду.

Стабильность к действию детергента Triton X-100. Устойчивость к действию ПАВ определяли двумя методами.

1. По изменению значений показателя оптической плотности дисперсий при добавлении детергента.

К липосомам добавляли рассчитанное количество Triton X-100, инкубировали смеси при перемешивании в течение 10 мин и проводили измерения оптической плотности при длине волны 400 нм. Для сравнения использовали липосомы на основе фосфатидилхолина.

2. По количеству вытекшей флуоресцентной краски из липосом.

Липосомы загружали водорастворимым красителем кальцеином на этапе гидратирования тонкой пленки. В качестве буфера для приготовления липосом использовали раствор, содержащий 270 мМ сахарозы, 2 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 4 мМ кальцеина, рН 7.0. Полученную дисперсию очищали от избытка красителя методом колоночной хроматографии (Sephadex G-100, superfine), элюируя фосфатным буфером (PBS) с рН 7.0. Эксперименты проводили в изоосматических условиях (335 ± 6 мОсм).

Количество вытекшей краски (%) в результате действия на липосомы детергента Triton X-100 рассчитывали по формуле:

где I_m – измеряемая интенсивность флуоресценции липосомы; I₀ и I₁₀₀ – интенсивность флуоресценции в начальный момент и после добавления Triton X-100 соответственно.

Встраивание доксорубицина. Липосомы из смеси КЛ : РС (1 : 1) загружали доксорубицином на этапе получения тонкой липидной пленки. Навеску доксорубицина (из расчета 400 мкг DOX на 1 мг липидов) растворяли в дистиллированной воде. Данным раствором гидратировали липидную пленку и подвергали ультразвуковой обработке в течение 50 мин при 40°С.

Не включившийся в везикулы препарат удаляли диализом в диализных мешках фирмы ELKAY Products, Inc., Type C с размером пор до 10 кДа в течение 3–6 ч. За ходом процесса следили по прекращению изменения показателя оптической плотности водной среды, окружающей диализный мешок. Измерения проводили в видимой области спектра поглощения DOX при длине световой волны 470 нм.

Включение препарата в липосомы (Х, %) рассчитывали по формуле:

где D₁ – оптическая плотность липосомальной дисперсии после диализа; D – оптическая плотность раствора исходной дисперсии.

Токсичность. Исследование цитотоксичности частиц проводили на линии клеток человеческой аденокарциномы молочной железы MCF-7 по данным МТТ-теста. Исследовали эффекты “пустых” и загруженных доксорубицином смешанных липосом на основе КЛ : РС 1 : 1. В качестве объекта сравнения использовали DOX без липосом. Клетки MCF-7 рассаживали по 7500 клеток в лунку в 96-луночный планшет. Результаты теста снимали через 48 ч.

Накопление частиц в клетках. Исследование накопления частиц в клетках проводили на линии клеток MCF-7. В качестве исследуемых дисперсий использовали смешанные липосомы на основе КЛ : РС 1 : 1, загруженные DOX.

Анализ распределения транспортных систем в клетке проводили с помощью конфокальной микроскопии. Эффективность накопления и локализация липосом в клетках была исследована с помощью конфокального лазерного микроскопа (Nikon TE-2000, Япония). Клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 (40 тыс. клеток на стекло) высеивали на покровные стекла в питательной среде DMEM, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FBS) и оставляли в CО₂-инкубаторе (5% CO₂, 37°С) на 24 ч. Для визуализации ядер старую среду заменяли свежей средой DMEM, содержащей краситель Hoechst 33 258 (50 мкM) и инкубировали клетки в течение 15 мин. Избыток красителя затем трижды отмывали физиологическим раствором на фосфатном буфере (pH 7.4), добавляли к клеткам дисперсию липосом в среде DMEM (0.5 мкл на 1 мл среды) и переносили в CO₂-инкубатор на 15 мин и 1 ч. Несвязанные частицы удаляли трехкратной промывкой PBS. Затем клетки фиксировали на покровных стеклах с помощью CC/Mount fluorophor protector и изучали с помощью конфокального микроскопа. Длина волны возбуждающего света 470 и 360 нм, эмиссии флуоресценции – 560–650 и 380–460 нм для доксорубицина и Hoechst 33 258 соответственно.

Трансфекция. Трансфекцию проводили на линии клеток эмбриональной почки человека HEK 293 в 48-луночном планшете. В качестве исследуемых дисперсий использовали катионные липосомы и смешанные липосомы на основе КЛ : DOPE 1 : 1. Клетки засевали в планшет в количестве 70 тыс. клеток на лунку в 300 мкл питательной среды DMEM и инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С в течение 24 ч до достижения монослоя. Дисперсию трансфекционного агента (смесь липосом и плазмидной ДНК) общим объемом 80 мкл готовили в бессывороточной среде OPTIMEM (соотношение N : P – 16 : 1). В качестве положительного контроля использовали коммерческий трансфекционный агент Lipofectamine-2000. В качестве отрицательного контроля использовали плазмиду pGL3. Приготовленные смеси выдерживали 30 мин при комнатной температуре, наносили на монослой клеток и инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С в течение суток. Далее методом люциферазного теста определяли активность люциферазы.

Люциферазный тест проводили с использованием коммерческого набора “Luciferase Assay System” (Promega, США). Для этого ростовую среду удаляли из лунок и добавляли 70 мкл лизирующего буфера “Glo lysis byffer 1x” (США). Клетки выдерживали 20 мин в СО₂-инкубаторе при 37°С для достижения полного лизиса. Затем клеточную суспензию отбирали со дна лунок и переносили в пробирки типа eppendorf. Полученный лизат центрифугировали в течение 3 мин при скорости 10 000 об/мин, отбирали по 50 мкл супернатанта и добавляли люциферазный субстрат в соотношении 1 : 1. Эффективность трансфекции оценивали по уровню люминесценции на приборе GloMax 20/20 luminometer (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что липосомальные транспортные системы доставки терапевтических молекул позволяют снизить общую токсичность переносимых веществ для организма и увеличить избирательность их накопления в клетках-мишенях. Важную роль в положительной динамике действия липосом играет их стабильность в системном кровотоке. Для ее обеспечения в систему можно вводить керасомообразующие липиды, которые за счет силоксановой сети на поверхности везикул способствуют увеличению стабильности, при этом не вызывая новых токсических эффектов [11]. Для применения липосом под конкретные цели целесообразно вводить в систему липиды-хелперы, например РС или DOPE [14–17]. Также для облегчения проникновения липосом в клетки-мишени применяют катионные липосомы [10].

В данной работе разработаны комплексные платформы адресной доставки нуклеиновых кислот и противоопухолевых препаратов на основе катионных липидов, керасомообразующих липидов и липидов-хелперов и проверена их эффективность в экспериментах in vitro. Предложена оригинальная схема и осуществлен синтез нового бивалентного керасомообразующего липида на основе L-орнитина для стабилизации платформы (схема 1 ). Использование аминокислот позволяет получать амфифилы простыми методами пептидной химии и предполагает снижение возможных токсических эффектов благодаря природным компонентам.

Схема 1.

Целевой КОЛ получали на основе L-орнитина. К ди-Вос-производному 1 присоединяли олеиламин и получали гидрофобную компоненту 2. После удаления защитных групп получали КОЛ 4 реакцией деблокированного гидрофобного блока 3 с (3-триэтоксисилил)пропилизоцианатом. Преимуществом выбранного реагента для формирования полярной головной группы липида является простота протекания реакции аминогруппы с изоцианатной группой при комнатной температуре. Кроме того, в структуре появляется производное мочевины, которая играет значительную роль в метаболизме многих веществ в организме [24]. Структуры полученных веществ подтверждали данными ИК- и ¹Н-ЯМР-спектроскопии.

В качестве катионных липидов были выбраны амфифилы на основе L-аланина (L-Ala) и L-серина (L-Ser), синтезированные нами ранее [23]. Они имеют общую схему строения и состоят из четырех структурных блоков: полярной головной группы, спейсера, линкера и гидрофобного домена (табл. 1). Во всех соединениях полярная головная группа сформирована L-лизином, несущим две протонируемые аминогруппы. В качестве спейсера выступает L-аспарагиновая кислота. Линкер представлен аминокислотами L-Ala, L-Ser, боковые радикалы которых остаются свободными в целевых амфифилах. Гидрофобный блок представлен производными алифатических спиртов 1-тетрадеканолом C₁₄H₂₉OH и 1-гексадеканолом C₁₆H₃₃OH.

Основой для выбора данных комбинаций аминокислот и алифатических спиртов стали результаты расчета гидрофильно-липофильного баланса и критического параметра упаковки. Значения ГЛБ и КПУ коррелируются с возможностью самоорганизации в липидный бислой [25] и, следовательно, с созданием транспортных систем доставки лекарственных веществ (ГЛБ ~ 9–12) и эффективной доставкой генетического материала в ходе трансфекции (ГЛБ ~ 13–16). Расчеты КПУ показали, что синтезированные соединения образуют сферические бислойные агрегаты в водной среде (табл. 1).

Из синтезированных соединений и липидов-хелперов (PC, DOPE) были получены липосомальные дисперсии. Для физико-химических и биохимических тестов были сформированы дисперсии из катионных липидов, смеси КЛ + РС, КЛ + DOPE, КЛ + КОЛ. В образцах смеси КЛ + РС липиды взяты в соотношениях 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2 для изучения наиболее оптимального соотношения. В смесях КЛ + DOPE и КЛ + КОЛ липиды взяты в соотношении 1 : 1 [26]. Методом фотонно-корреляционной спектроскопии были определены размеры частиц дисперсий на основе КЛ и КЛ + КОЛ. Диаметр липосом на основе всех катионных липидов не превышает 235 нм, что дает возможность им проникать в мелкие кровеносные сосуды (рис. 1а). Наибольший размер имеют агрегаты на основе L-аланина, это может быть следствием наличия двух объемных метильных групп в структуре липидов. Кроме того, удлинение углеводородных радикалов в гидрофобном блоке приводит к увеличению размеров частиц более чем на 60 нм для всех амфифилов. Наиболее компактными везикулами являются соединения на основе L-серина, их средний размер 82.9 нм. Добавление к катионным липидам керасомообразующего липида приводит к увеличению размеров агрегатов более чем в 1.5 раза для всех образцов (рис. 1б). Наибольший размер имеют липосомы с длиной углеводородного радикала 16 атомов углерода. Полученные значения для образцов KD(A16)2 и KD(S16)2 выходят за пределы оптимального диапазона распределения размеров частиц для эффективных липосомальных транспортных систем (не более 350 нм).

Для дисперсий на основе КЛ и КЛ + КОЛ определен дзета-потенциал, который является одним из факторов устойчивости золей и дисперсных систем в водной среде. Известно, что наличие заряда на поверхности частиц препятствует их агрегации за счет электростатического отталкивания. Значения дзета-потенциала, лежащие в диапазоне 30–50 мВ, характеризуют систему как стабильный коллоидных раствор [27]. Для всех катионных липосом значения дзета-потенциала лежат в диапазоне 31–43 мВ (рис. 1в). Наличие в структуре ОН-групп L-серина приводит к незначительному уменьшению дзета-потенциала по сравнению с соединениями на основе L-аланина. Все смешанные липосомы КЛ + КОЛ имеют поверхностный заряд ниже, чем дисперсии на основе катионных липидов (29–36 мВ) (рис. 1г). Введение КОЛ оказывает существенное влияние на везикулы из липопептидов, в структуре которых присутствуют L-аланин. При этом значения дзета-потенциала для L-серина практически не меняются. Это можно объяснить количеством ОН-групп, которые образуются при гидролизе силоксановых головок керасомообразующего липида. Подтверждением гидролиза триэтоксисилильных групп в структуре КОЛ с последующим образованием полисилоксановой сети на поверхности везикул являются данные масс-спектрометрии MALDI или ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием [28]. Данные масс-спектрометрии MALDI показали, что для смешанных липосом КЛ + КОЛ на основе L-аланина возможен гидролиз только части триэтоксисилильных групп (рис. S1 ). В смешанных липосомах КЛ + КОЛ на основе L-серина может происходить гидролиз всех триэтоксисилильных групп (рис. S2 ). Масс-спектрометрические исследования показали, что большинство липидных олигомеров находятся в виде мономеров или димеров.

Для липосом на основе КЛ, КЛ + КОЛ и КЛ + РС (2 : 1, 1 : 1, 1 : 2) была изучена стабильность при хранении при комнатной температуре и к действию дестабилизирующего агента Triton X-100. В качестве контроля были использованы липосомы из фосфатидилхолина. Для всех катионных липосом он оставался постоянным не менее 13 дней, а для смешанных липосом КЛ + КОЛ – не менее 15 дней. Увеличение количества фосфатидилхолина в липосомах на основе КЛ + РС (2 : 1, 1 : 1, 1 : 2) приводило к более скорой агрегации при комнатной температуре, а соотношение 1 : 1 оказалось оптимальным (не менее 7 дней) и было взято для эксперимента с детергентом. Результаты экспериментов с Triton X-100 свидетельствуют о том, что катионные и смешанные липосомы в несколько раз устойчивее к действию дестабилизатора по сравнению с липосомами на основе фосфолипида (рис. 2). Данные изменения оптической плотности указывают на то, что липосомы из фосфолипидов практически полностью солюбилизировались под действием детергента даже при небольшом их количестве, тогда как дисперсии исследуемых образцов стабильны при соотношениях n(Triton X-100)/n(липид) более, чем 20 : 1 (рис. 2а и 2б). Аналогичный результат был получен в экспериментах с вытеканием водорастворимого красителя кальцеина из липосом (рис. 2в). Кальцеин полностью вытекает из липосом на основе фосфолипида РОРС в течение 5 мин, тогда как для катионных и смешанных липосом выход красителя не превысил 10% за 10 мин. Это указывает на значительно большую устойчивость дисперсий из вновь синтезированных липидов.

Совокупность полученных данных о мембранообразующих свойствах липосом говорит о том, что дальнейшее применение смеси КЛ + КОЛ в экспериментах in vitro является нецелесообразным. Исследуемый КОЛ существенно не увеличивает стабильность агрегатов, при этом за счет двух силоксановых головок размер частиц возрастает более чем в 1.5 раза.

Смешанные липосомы КЛ + РС (1 : 1) исследовали на способность встраивать противоопухолевый препарат доксорубицин. Липидные пленки гидратировали водным раствором доксорубицина из расчета 400 мкг DOX на 1 мг липидов и подвергали обработке ультразвуком в течение 50 мин при 40°С. Липосомы KD(A16)2 на основе L-аланина показали лучший результат захвата антибиотика (81.6%), который может быть связан с большим размером частиц по сравнению с остальными образцами (рис. 3а).

Для определения безопасных рабочих концентраций изучена цитотоксичность дисперсий липосом. Исследование проводили на линии клеток человеческой аденокарциномы молочной железы MCF-7 по данным МТТ-теста. В качестве исследуемых объектов использовали “пустые” и загруженные доксорубицином смешанные липосомы на основе КЛ + РС = 1 : 1. В качестве контроля выступал чистый DOX. Результаты теста регистрировали через 48 ч. Все образцы “пустых” липосом являются менее токсичными, чем липосомы, загруженные антибиотиком (рис. 3б). Наиболее токсичным оказался образец KD(А16)2, IC₅₀ которого составляет 0.125 мг/мл. Его токсичность может быть вызвана высокой гидрофобностью молекулы за счет L-аланина. Образец KD(S16)2 является самым безопасным, показатель IC₅₀ составляет 0.475 мг/мл, а безопасная рабочая концентрация – 0.24 мг/мл. Токсичность липосом, нагруженных доксорубицином, ниже токсичности чистого DOX (рис. 3в). При этом для образца KD(А16)2 высокая токсичность проявляется уже при концентрации 0.10 мг/мл. Такой эффект может быть вызван разной степенью загрузки DOX и устойчивостью агрегатов в условиях in vitro и, следовательно, скоростью высвобождения препарата из липосом.

На линии клеток MCF-7 с помощью конфокальной микроскопии проведен анализ распределения и накопления транспортных систем КЛ + РС = = 1 : 1, загруженных доксорубицином, в клетке (рис. 4). Липосомы преодолевали плазматическую мембрану, проникали в клетку в течение 15 мин и локализовались в цитоплазме, а затем в течение 1 ч аккумулировались в мембране ЭПР. Наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдалась для образцов KD(A16)2 и KD(S14)2. KD(A16)2 уже через 15 мин практически полностью накапливался в мембране ЭПР, а KD(S14)2 в течение 15 мин локализовался в цитоплазме и через 1 ч – в ЭПР. Образцы KD(A14)2 и KD(S16)2 в течение 1 ч накапливались только в цитоплазме.

На линии клеток эмбриональной почки человека HEK 293 изучена эффективность трансфекции смешанных липосом на основе КЛ + DOPE = = 1 : 1, оценивая уровень свечения исследуемых образцов после введения в клетки липоплексов с плазмидой, кодирующей ген люциферазы. В качестве положительного и отрицательного контролей использовали коммерческий Lipofectamine-2000 и плазмиду pGL3 соответственно. Соотношение липосом и плазмидной ДНК (P : N) было 1 : 16. Липосомы на основе КЛ с 14 атомами углерода в гидрофобном блоке показали результаты, в несколько раз превышающие уровень трансфекционной активности Lipofectamine-2000 (рис. 5). При этом наличие в структуре ОН-групп L-серина позволяет достичь высокой эффективности трансфекции независимо от длины углеводородных радикалов в гидрофобном домене. Введение остатков 1-гексадецилового спирта в структуру липида с L-аланином снижало трансфекционную активность ниже уровня активности коммерческого агента.

Таким образом, в ходе работы проведено комплексное изучение физико-химических, мембранообразующих и биохимических свойств липосомальных средств доставки противоопухолевого препарата и нуклеиновых кислот. Установлено, что комплексы с КОЛ имеют свойства, ограничивающие их использование в экспериментах in vitro. Липосомы на основе L-аланина хорошо аккумулируются в клетках и проявляют трансфекционную активность, однако они токсичны. Соединения на основе L-серина являются перспективными для использования в качестве агентов доставки лекарственных веществ и генетического материала в клетки.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП РТУ МИРЭА при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.