Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2020, T. 37, № 1, стр. 53-60

ВВЕДЕНИЕ

Гормоны щитовидной железы – тироксин (Т₄) и трийодтиронин (Т₃) – играют важную роль в регуляции многих функций организма, в том числе работы сердечно-сосудистой системы. Хорошо известно, что тиреоидные гормоны повышают сократимость миокарда и что этот эффект обусловлен влиянием этих гормонов на сократительный аппарат кардиомиоцитов и механизмы, ответственные за регуляцию цитоплазматической концентрации Са²⁺ [1].Тиреоидные гормоны увеличивают экспрессию гена сердечной изоформы миозина αMHC, которая обладает более высокой ATP-азной активностью, и снижают экспрессию гена βMHC. Они повышают экспрессию гена рианодиновых рецепторов (RyR2), которые формируют Са²⁺-каналы саркоплазматического ретикулума, и гена Ca²⁺-зависимой ATP-азы (Serca2), которая обеспечивает закачку Са²⁺ в депо и ускорение расслабления кардиомиоцитов [2–4]. Кроме того, Т₃ потенцирует инотропные эффекты катехоламинов путем стимуляции экспрессии β₁-адренорецепторов (β₁-AR) [2, 5, 6].

Долговременные эффекты тиреоидных гормонов в кардиомиоцитах опосредованы ядерными рецепторами и связаны с изменением транскрипции генов с гормон-чувствительными последовательностями в промоторном регионе [7]. T₃ по сравнению с Т₄ более активен, поскольку обладает более высоким сродством к ядерным рецепторам, в том числе к рецептору TRα₁, ключевой мишени тиреоидных гормонов в кардиомиоцах [4, 8]. Локальный синтез Т₃ из Т₄ в кардиомиоцитах обеспечивает дейодиназа 2 типа (D2) [4, 9], в связи с этим этот фермент является важным участником тиреоидной регуляции сердца.

Физическая тренировка в аэробном режиме нагрузки повышает выносливость скелетных мышц и оказывает благоприятное влияние на работу сердца [10–12], что, среди прочих механизмов, может быть связано с влиянием тиреоидных гормонов. С одной стороны, физическая нагрузка изменяет работу гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси, продукцию гормонов щитовидной железой и их потребление тканями [13–15]. С другой стороны, локальный синтез T₃ с участием D2 является необходимым условием адаптивного повышения экспрессии генов в работающих скелетных мышцах [16], однако в сердце такая регуляторная роль D2 пока не изучена. Таким образом, вопрос об источниках Т₃ и его роли в изменении транскриптома кардиомиоцитов при аэробной нагрузке пока остается открытым.

Целью нашей работы было оценить влияние физической тренировки на уровни экспрессии генов, регулирующих сократительную функцию сердца, и изучить взаимосвязь содержания мРНК этих генов с показателями системной и локальной продукции Т₃: содержанием Т₃ в крови и экспрессией D2 в миокарде, соответственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Исследования проводили на самцах крыс Вистар по пpотоколу, одобренному комиссией по биомедицинcкой этике ГНЦ PФ – ИМБП PАН. Животных содержали в помещении вивария с контролируемой температурой и световым циклом 12/12 ч (включение освещения – 9⁰⁰, выключение – 21⁰⁰). Воду и корм для грызунов (ООО “Лабораторкорм”, Москва) крысы получали ad libitum.

Физическая тренировка крыс. Тренировку крыс проводили в режиме произвольного бега с использованием разработанного нами аппаратно-программного комплекса [17]. В возрасте 5 недель крыс попарно помещали в клетки стандарта T3 с беговым колесом для адаптации к экспериментальным условиям. Через неделю крыс рассаживали индивидуально в клетки без бегового колеса (группа “Контроль”) или в клетки с постоянным доступом к колесу (группа “Тренировка”). На ободе колеса диаметрально друг относительно друга были установлены два магнита для детекции каждого полуоборота колеса. Для непрерывной регистрации и анализа показателей беговой активности крыс использовали оригинальное программное обеспечение. Длительность тренировочного цикла составила 8 недель.

Анализ содержания гормонов в крови. Для определения содержания тиреоидных гормонов у крыс из надреза кончика хвоста под местной анестезией брали пробы смешанной крови (500 мкл). Из образцов крови получали сыворотку и замораживали ее при –20°С [17, 18]. Определение содержания общего Т₄ и свободного Т₃ в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа с использованием наборов ЗАО “НВО Иммунотех” (Россия).

Получение образцов мышечной ткани. Взятие тканей проводили строго в одно и то же время суток (с 9.00 до 9.30 утра). За 20 ч до получения образцов мышечной ткани беговые колеса были удалены из экспериментальных установок для исключения острого (краткосрочного) влияния физической нагрузки на экспрессию генов. Крыс наркотизировали CO₂ и декапитировали гильотиной, затем выделяли и взвешивали желудочки сердца (правый отдельно, левый с перегородкой) и камбаловидную мышцу. Образцы ткани левого желудочка и камбаловидной мышцы замораживали в жидком азоте и хранили при –70°С до проведения исследований экспрессии генов.

Исследование уровня экспрессии генов (количественная ПЦР с обратной транскрипцией). Экстракцию тотальной РНК из образцов мышечной ткани проводили с помощью набора Clean RNA Standard (Евроген, Россия) по протоколу производителя с некоторыми модификациями. Концентрацию нуклеиновых кислот в полученных образцах измеряли с помощью спектрофотометра (NanoDrop 2000, The Thermo Scientific, США). Полученные образцы РНК были обработаны ДНКазой I (Fermentas, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) проводили обратную транскрипцию с тотальной РНК (200 нг) с использованием набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия) и праймеров со случайными последовательностями нуклеотидов длиной 6 п.н. согласно прилагаемой инструкции. Синтезированную кДНК хранили при –70°С до проведения количественной ПЦР.

Праймеры для проведения ПЦР были синтезированы в ЗАО Евроген (Россия). Последовательности прямых и обратных праймеров для целевых и референсных генов приведены в табл. 1. ПЦР в реальном времени проводили в амплификаторе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Программа амплификации включала начальную денатурацию при 95°С (10 мин), 40 циклов ПЦР (30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 60 с при 72°С) и заключительную инкубацию при 72°С (10 мин).

Определение количества мРНК исследуемых генов относительно мРНК референсных генов (среднее геометрическое по трем генам – GAPDH, β-актин и циклофилин) было выполнено методом ΔΔCt. Содержание мРНК каждого из генов в образце мышечной ткани тренированных крыс выражали в процентах относительно среднего содержания соответствующей мРНК у контрольных крыс.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев Манна–Уитни и Вилкоксона. Для корреляционного анализа данных вычисляли непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Pазличия cчитали cтатиcтичеcки значимыми пpи p < 0.05. Данные в тексте, в таблицах и на рисунках приведены в виде медианы и межквартильного размаха, n – объем выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В течение тренировочного цикла крысы проявляли беговую активность в темное время суток. За 8 недель тренировки суммарный пробег составил 142.7 (93.5; 261.8) км, суммарное время бега – 76.2 (60.3; 119.3) ч, а средняя скорость в интервалах бега – 29.6 (24.5; 34.3) м/мин. Масса тела крыс к концу эксперимента значительно увеличилась, но не различалась между группами. Вместе с тем относительная масса камбаловидной мышцы у тренированных крыс была увеличена по сравнению с контролем (табл. 2). Уровень экспрессии мРНК цитратсинтазы в этой мышце у бегающих крыс был вдвое выше, чем в контрольной группе: 205.8 (178.5; 243.5)% и 100.0 (75.6; 146.5)%, соответственно (p < 0.05).

Относительная масса желудочков сердца у тренированных и контрольных животных не различалась (табл. 2). Также не выявлено межгрупповых различий в уровне экспрессии сердечных изоформ миозина (αMHC и βMHC) (рис. 1).

Рис. 1.

Относительные уровни экспрессии генов в миокарде левого желудочка у контрольных (n = 7) и тренированных (n = 9) крыс. За 100% принято среднее значение содержания мРНК данного гена в контрольной группе. *р < 0.05 по сравнению с контролем (критерий Манна–Уитни).

Содержание общего Т₄ в крови (показатель секреторной активности щитовидной железы) в результате тренировки не изменилось, но содержание свободного Т₃ (активная форма гормона) заметно увеличилось в результате тренировки (табл. 2). Уровни экспрессии мРНК TRα₁ у двух групп крыс не различались (рис. 1). Однако у тренированных крыс наблюдалось двукратное повышение экспрессии мРНК D2 по сравнению с контролем (рис. 1). При этом в группе “Тренировка” была выявлена отрицательная корреляция между уровнем T₃ в крови и экспрессией мРНК D2 в миокарде (рис. 2а). В группе “Контроль” такой зависимости не наблюдалось, по всей видимости, в связи с низкой вариабельностью у контрольных крыс как уровня T₃, так и экспрессии D2 (рис. 2а).

Рис. 2.

Взаимосвязь показателей тиреоидного статуса и генной экспрессии в группах “Контроль” (белые кружки, n = 7) и “Тренировка” (черные кружки, n = 9). а – Корреляция содержания свободного T₃ в крови и мРНК дейодиназы 2 (D2) в миокарде. б, в, г – Корреляция содержания мРНК D2 и мРНК Ca²⁺-зависимой ATP-азы (Serca2, б), мРНК α₁ субъединицы потенциал-управляемых кальциевых каналов L-типа (Cav 1.2, в) и мРНК рианодиновых рецепторов 2 типа (RyR2, г). r – Коэффициент корреляции Спирмена, p – уровень статистической значимости.

В нашей работе не было обнаружено статистически значимых изменений содержания мРНК β₁-AR, Cav 1.2, Serca2, RyR2 и PLB в миокарде тренированных крыс, однако у большинства животных уровни экспрессии Cav 1.2, Serca2 и RyR2 превышали средний уровень в контроле (рис. 1). В связи с этим представлялось интересным исследовать взаимосвязи содержания мРНК этих генов и D2 в миокарде. В группе “Тренировка” были выявлены положительные корреляции содержания мРНК D2 и Serca2 (рис. 2б), D2 и Cav 1.2 (рис. 2в), а также D2 и RyR2 (рис. 2г). В контрольной группе ни для одного из перечисленных выше генов не было выявлено статистически значимой корреляции с экспрессией гена D2, что также может объясняться низкой внутригрупповой вариабельностью показателей.

Следует также отметить, что ни в одной из экспериментальных групп не было выявлено корреляции между содержанием мРНК генов-регуляторов кальциевого гомеостаза кардиомиоцитов и содержанием свободного Т₃ в крови. Коэффициенты корреляции с уровнем свободного Т₃ для содержания мРНК RyR2, Cav 1.2 и Serca2 составили –0.45 (p = 0.230), –0.48 (p = 0.188) и –0.54 (p = = 0.127) соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате произвольной беговой тренировки у крыс выявлены изменения тиреоидной регуляции как на системном, так и на локальном уровне: повышение содержания Т₃ в крови и уровня экспрессии мРНК D2 в миокарде левого желудочка, соответственно. При этом у тренированных, но не контрольных крыс содержание мРНК трех генов-регуляторов кальциевого гомеостаза кардиомиоцитов положительно коррелировало с миокардиальным уровнем экспрессии D2, но не с системным уровнем Т₃.

Прежде всего следует отметить, что в результате использованной нами методики тренировки (произвольный бег в колесе) у крыс наблюдалась умеренная гипертрофия локомоторной (камбаловидной) мышцы и повышение в ней экспрессии мРНК цитратсинтазы. В нашей предыдущей работе, где применялась аналогичная методика тренировки крыс, в локомоторной мышце было выявлено выраженное повышение белков OXPHOS, принадлежащих к различным комплексам дыхательной цепи митохондрий [19]. Сходные результаты описаны и другими авторами [20, 21]. В совокупности эти данные говорят об эффективном влиянии произвольной беговой тренировки на окислительный потенциал локомоторных мышц.

В нашей работе после произвольной беговой тренировки у крыс наблюдалось увеличение содержания Т₃ в крови. Предыдущие работы говорят, что влияние физической тренировки на состояние гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси зависит от параметров и субъективной переносимости нагрузки. Так, в экспериментах на крысах интенсивная тренировка на беговой дорожке может сопровождаться снижением содержания в крови тиреотропного гормона, Т₄ и Т₃ [22], тогда как тренировка в бесстрессовых условиях (произвольный бег в колесе) не вызывает таких изменений [14].

Следует отметить, что повышение свободного Т₃ в крови крыс наблюдалось на фоне неизменного уровня Т₄, который отражает общую секреторную активность щитовидной железы. Такое соотношение уровней двух форм тиреоидных гормонов может быть связано с влиянием физической тренировки на экспрессию и активность дейодиназы первого типа (D1). D1 локализована в щитовидной железе, печени и почках и является основным источником циркулирующего в крови Т₃, в отличие от D2, которая синтезирует Т₃ преимущественно для собственных нужд клетки [9, 23]. Вторым объяснением может служить изменение содержания или же некоторое превышение буферной емкости белков-переносчиков тиреоидных гормонов в крови тренированных крыс при повышении содержания Т₃. К сожалению, на основании измерения только двух форм тиреоидных гормонов мы не можем сказать, какое из приведенных выше объяснений верное. Отметим, что повышение циркулирующего Т₃ в крови было недостаточным для ингибирования тиреоидной оси по механизму отрицательной обратной связи.

Повышение содержания свободного Т₃ в крови является предпосылкой для его влияния на экспрессию генов в миокарде. Среди многочисленных мишеней Т₃ в кардиомиоцитах наиболее интересными для нас были ген D2, а также гены-регуляторы обмена Са²⁺ в кардиомиоцитах. Известно, что тиреоидные гормоны подавляют экспрессию гена D2 [24]. В связи с этим вполне закономерна выявленная нами в группе тренированных крыс отрицательная корреляция между системным уровнем свободного Т₃ и содержанием мРНК D2 в миокарде. В контрольной группе крыс вариабельность этих показателей сравнительно невелика, тогда как тренировка приводит к возникновению их значительных индивидуальных различий. Однако, несмотря на негативное влияние Т₃, уровень экспрессии D2 в миокарде после тренировки все же увеличен по сравнению с контролем. Очевидно, что межгрупповые различия в экспрессии D2, возникающие в результате тренировки, обусловлены влиянием не циркулирующего в крови T₃, а иными, но также связанными с физической активностью механизмами. Ранее было показано, что уровень экспрессии D2 в бурой жировой ткани повышается при симпатической стимуляции [5, 6], а повышение экспрессии D2 в скелетных мышцах при беговой нагрузке устраняется блокадой β-адренорецепторов [16]. Как известно, физическая нагрузка связана с повышением активности симпатической нервной системы [25], которое может служить стимулом к увеличению экспрессии D2 в миокарде. Следует отметить, что, согласно общепринятой точке зрения, активность D2 преимущественно определяется ее содержанием в клетках [23].

Мы не обнаружили статистически значимых изменений экспрессии мРНК генов-регуляторов кальциевого гомеостаза в сердце тренированных крыс. Следует отметить, что влияние физической тренировки на экспрессию этих генов в миокарде исследовано мало, и нам удалось найти лишь одну работу по этому вопросу [26]. Авторы этой работы также не обнаружили изменения содержания мРНК β₁-AR, Cav 1.2, Serca2, RyR2 и PLB в левом желудочке самок крыс при беговой тренировке в колесе в течение 7 недель. Возможно, интенсивность нагрузки при произвольной беговой тренировке недостаточно высока для выраженного потенцирования экспрессии этих генов.

Вместе с тем хорошо известно, что увеличение сократимости сердечной мышцы под действием T₃ связано с повышением экспрессии генов RyR2 и Serca2 [2–4]. Нами выявлены положительные корреляции экспрессии мРНК D2 и генов RyR2, Cav1.2, Serca2 в группе тренированных крыс. Наличие таких корреляций предполагает, что увеличение экспрессии D2 вследствие тренировки приводит к локальному повышению продукции T₃ в кардиомиоцитах и, следовательно, росту экспрессии генов, регулирующих их кальциевый гомеостаз.

В контрольной группе крыс содержание мРНК RyR2, Cav 1.2 и Serca2 не коррелирует с экспрессией D2: индивидуальные различия этих показателей у нетренированных крыс невелики, что, среди прочих причин, может быть обусловлено влиянием отрицательной связи между внутриклеточным уровнем T₃ и экспрессией D2 (сдвиг одного из показателей может компенсироваться за счет противоположного изменения другого). У тренированных крыс повышение активности симпатоадреналовой системы стимулирует экспрессию D2, что приводит к локальному увеличению продукции T3, активации тиреоидного сигналинга и росту экспрессии генов RyR2, Cav 1.2 и Serca2.

Следует отметить, что мы проводили анализ экспрессии генов Serca2 и RyR2 с учетом всех возможных транскрипт-вариантов (трех вариантов для Serca2 и двух – для RyR2). Показано, что различные транскрипт-варианты Serca2 экспрессируются с одного промотора, в котором имеются тироид-чувствительные элементы [27]. В связи с этим именно суммарное повышение экспрессии транскрипт-вариантов должно отражать влияние Т₃ на экспрессию гена Serca2, что было принципиальным для решения нашей задачи. Для гена RyR2 показана четкая связь снижения суммарной экспрессии его транскрипт-вариантов с развитием сердечной недостаточности у крыс [28]. Вместе с тем результаты нашей работы не позволяют однозначно судить о влиянии физической тренировки на механизмы кальциевого гомеостаза кардиомиоцитов, для ответа на этот вопрос нужны дальнейшие исследования.

Таким образом, в данной работе впервые показано, что адаптивное изменение экспрессии генов-регуляторов кальциевого гомеостаза в миокарде при физической тренировке связано с повышением экспрессии D2 и, следовательно, локального синтеза Т₃. Маловероятно, что оно обусловлено действием циркулирующего Т₃: отрицательная корреляция концентрации Т₃ в крови с содержанием мРНК D2 предполагает скорее снижение, а не повышение экспрессии Serca2, Cav 1.2 и RyR2 в кардиомиоцитах, что противоречит многочисленным данным литературы [1–4]. Мы полагаем, что влияние произвольной тренировки на обмен ионов кальция в кардиомиоцитах обусловлено действием не циркулирующего, а локально синтезируемого в кардиомиоцитах Т₃. В связи с этим физическая нагрузка умеренной интенсивности может быть использована для профилактики снижения и коррекции сократимости сердечной мышцы при заболеваниях различной природы, включая гипотиреоидные состояния.

Работа выполнена по плану фундаментальных исследований ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Исследования экспрессии генов проведены при поддержке РФФИ (грант № 19-015-00482).