Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 2, стр. 130-134
Определение витамина Е (ацетата α-токоферола) на поверхности кожи человека методом ИК-Фурье спектрометрии и изучение некоторых аспектов его трансдермального переноса
И. Н. Фадейкина a, *, Е. С. Пеункова a, Б. К. Зуев b
a Государственный университет “Дубна”
141980 Московская обл., Дубна, ул. Университетская, 19, Россия
b Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского Российской академии наук
119991 Москва, ул. Косыгина, 19, Россия
* E-mail: i.fadeikina@yandex.ru
Поступила в редакцию 25.05.2020
После доработки 22.07.2020
Принята к публикации 18.08.2020
Аннотация
Рассмотрены возможности применения метода ИК-Фурье спектрометрии для определения органических веществ на поверхности кожи человека и изучения некоторых аспектов трансдермального переноса косметических активов с поверхности во внутренние слои кожи. В качестве исследуемого косметического актива выбран витамин Е в форме ацетата альфа-токоферола. Предложена методика определения изменения концентрации витамина Е с течением времени, использован пробоотбор с применением стандартных таблеток бромида калия, получена зависимость, иллюстрирующая уменьшение концентрации косметического актива во времени. Показано, что ИК-Фурье спектрометрию можно применять как простой и экспрессный метод исследования механизмов переноса веществ и изучения трансдермальных свойств кожи.
Появление и внедрение новых активных компонентов косметических средств требует исследования их свойств, знания эффективной концентрации на поверхности кожи и их действия на кожу человека. Для этого необходимы новые методы обнаружения таких сложных компонентов, как гиалуроновая кислота, пептиды, витамины и т.п., а также разработка способов определения их концентрации и изучения особенностей проникновения в кожу (трансдермальные свойства кожи).
Трансдермальные свойства кожи – один из главных вопросов в косметологии и дерматологии. Подобные исследования нужны для определения характеристик и показателей кожи при выборе стратегии лечения и косметических средств; для изучения механизмов и кинетических параметров переноса активных веществ, нанесенных на кожу; для расчета нормы ввода активных компонентов в состав лекарственных и косметических средств и времени их воздействия. На сегодня разработаны и охарактеризованы методы определения основных характеристик кожи: рН, жирности (липидный баланс), увлажненности (сухость), пигментации, механических свойств, микроциркуляции и внутренних структур кожи; определен и описан химический состав гидро-липидной мантии и естественных увлажняющих компонентов на поверхности кожи; описано несколько математических моделей, рассматривающих перенос веществ через кожу как через мембрану и как через диффузионную ячейку для некоторых лекарственных препаратов [1–3]. Существующие методы изучения процессов взаимодействия лекарственных и косметических препаратов с кожей являются, как правило, трудоемкими и дорогостоящими. Данные по эффективности проникновения наночастиц серебра через кожу человека, полученные с использованием методов UV-Vis спектроскопии и сканирующей просвечивающей электронной микроскопии, описаны в работе [4]. Методом ВЭЖХ–масс-спектрометрии исследована [5] доставка ацетиласпаргиновой кислоты в глубокие слои кожи в течение 24 ч и получены данные о динамике диффузии in vitro. Атомно-абсорбционную спектрометрию применили [6] в исследованиях кожи для определения остаточных концентраций металлов, поступивших из внешней среды. Для определения гиалуроновой кислоты на поверхности кожи человека и получения зависимости проникновения гиалуроновой кислоты в кожу человека от времени использовали метод окситермографии [7–9]. Методика определения поверхностной концентрации гиалуроновой кислоты основана на контроле переноса органического вещества с поверхности кожи на чистую шероховатую поверхность кварцевого пробоотборника. Органическое вещество на поверхности пробоотборника определяли методом окситермографии с использованием воздуха в качестве окислительной среды.
В работе [10] рассмотрены модели человеческой кожи с использованием прототипов в виде целлофановой пленки и кожного покрова уха свиньи. Следует отметить, что в исследовании участвовали липосомальная и микроэмульсионная формы альфа-токоферола.
Классическим методом определения органических веществ является ИК-Фурье спектрометрия [11]. Однако имеется ряд вопросов, связанных с возможностью применения данного метода к такому сложному биологическому объекту, как кожа, со способами пробоотбора органического вещества с поверхности кожи, а также с решением проблем определения низких концентраций веществ. Дополнительные затруднения возникают при учете индивидуального состава смеси веществ на поверхности кожи и индивидуального распределения зон с повышенным содержанием веществ у каждого человека, сложного и меняющегося во времени состава этой смеси, различных механизмов переноса для гидрофильных и липофильных веществ, сложности пробоотбора и разделения компонентов смеси.
Цель данной работы – разработка методики определения косметического вещества (на примере витамина Е), нанесенного в виде тонкой пленки на поверхность кожи человека, с использованием метода ИК-Фурье спектрометрии и построение зависимости изменения концентрации косметического препарата на поверхности кожи человека от времени для характеристики особенностей его трансдермального переноса.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Методика определения косметических веществ на поверхности кожи человека для изучения их трансдермального переноса включала следующие этапы:
1) Выбор на поверхности кожи человека однородного участка (без повреждений и избыточного волосяного покрова).
2) Подготовка поверхности кожи перед нанесением косметического актива (очищение и обезжиривание).
3) Равномерное нанесение на поверхность кожи косметического актива в исследуемой форме.
4) Пробоотбор нанесенного органического вещества через определенные промежутки времени с различных участков поверхности кожи.
5) Определение органического вещества на поверхности пробоотборника с использованием метода ИК-Фурье спектрометрии.
6) Построение и анализ зависимости изменения концентрации косметического вещества на поверхности кожи человека от времени.
Данную методику опробовали при изучении трансдермального переноса витамина Е в форме альфа-токоферола ацетата. Витамин Е относится к малоопасным веществам (4 класс опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76), поэтому предварительных исследований на животных и модельных объектах не требовалось. Целевая группа исследования: девушки от 18 до 24 лет (живые люди). Область исследования: кожа рук на внутренней поверхности локтевого сустава.
Перед нанесением косметического актива поверхность кожи очищали и обезжиривали 85%-ным раствором этанола и высушивали. В качестве пробоотборника использовали стандартные таблетки из кристаллического KBr (для ИК-спектрометрии; Shimadzu, Япония). Таблетки диаметром 1 см, толщиной 2 мм, массой 200 мг готовили прессованием с использованием гидравлического пресса со специальной пресс-формой при давлении 7 атм. Для отбора пробы таблетку прикладывали к анализируемой поверхности в течение фиксированного промежутка времени. Каждый раз для анализа нового участка поверхности кожи использовали новую таблетку KBr.
Органические вещества, перенесенные на поверхность таблетки KBr, определяли с помощью ИК-спектрометра с Фурье-преобразованием IRaffinity-1s (Shimadzu, Япония) в режиме пропускания со специальным держателем для таблеток. Прибор дает возможность получать ИК-спектры в диапазоне 650–4000 см–1. Программное обеспечение IRSolution и LabSolution позволяет регистрировать спектры в режимах пропускания и поглощения с представлением суммарной интенсивности как в процентах, так и в единицах энергии. Кроме того, имеется возможность использовать стандартные подходы при обработке спектров – проводить нормализацию, строить базовую линию, работать с интегральным спектром или с отдельным характеристическим пиком.
Для выбора аналитических линий получили ИК-спектр витамина Е (рис. 1). Наиболее удобными для обработки оказались характеристические линии в спектральных диапазонах 3200–2700 см–1, 1800–1700 см–1, а также набор полос в области 1500–1000 см–1.
Рис. 1.
ИК-спектры витамина Е на поверхности пробоотборника, использованные для построения градуировочной зависимости. Концентрация витамина Е, мкл/см2: 1 – 1.49, 2 – 0.42, 3 – 0.21, 4 – пустая таблетка KBr.
Строили градуировочную зависимость аналитического сигнала от концентрации альфа-токоферола. Градуировочные растворы готовили из жидкого альфа-токоферола ацетата (Тульская фармацевтическая фабрика) разбавлением, в качестве растворителя использовали CCl4 (чистый для ИК- и УФ-спектрометрии; Вектон, Россия). Исследуемые растворы готовили непосредственно перед проведением измерений. Аликвоты отбирали при помощи набора микропипеток серии “LENPIPET” (диапазоны объемов 5–50, 100–1000 и 1000–10 000 мкл, точность отбора аликвоты ±1.5%).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве аналитической полосы выбрали спектральный диапазон 1800–1700 см–1 с основным пиком, соответствующим колебаниям связи С=О в исследуемом веществе. Данный диапазон содержит характеристическую полосу поглощения, которая не перекрывается с полосами, соответствующими колебаниям других групп, и позволяет установить четкую зависимость площади или высоты пика от количества вещества на поверхности таблетки КВr. При исследовании кинетики трансдермального переноса рассматривали также характеристические полосы при 2800 см–1, соответствующие валентным колебаниям связи С–Н, и при 1200 см–1, соответствующие колебаниям группы С–О–С, обладающие высокой интенсивностью.
Для количественного определения содержания витамина Е на поверхности таблетки-пробоотборника приготовили шесть градуировочных растворов в CCl4 с концентрацией витамина Е от 75 до 1.25 мкл/мл. На поверхность таблеток KBr равномерно наносили 20 мкл приготовленного градуировочного раствора. Для получения градуировочной зависимости рассчитанную концентрацию на поверхности пробоотборника сопоставляли с интенсивностью выбранного характеристического пика при 1750 см–1 (табл. 1). В качестве базовой линии рассматривали спектр поглощения пустой таблетки KBr (рис. 1).
Таблица 1.
Зависимость высоты ИК-пика от поверхностной концентрации витамина Е на таблетке КВr при 1750 см–1
| Концентрация витамина Е в приготовленных растворах, мкл/мл | Концентрация витамина Е на поверхности таблетки KBr, мкл/см2 | Высота пика, отн. ед. |
|---|---|---|
| 1.25 | 0.01 | 0.000 ± 0.012 |
| 7.5 | 0.10 | 0.016 ± 0.012 |
| 10 | 0.14 | 0.035 ± 0.012 |
| 15 | 0.21 | 0.220 ± 0.011 |
| 30 | 0.42 | 0.514 ± 0.026 |
| 75 | 1.49 | 1.49 ± 0.07 |
Уравнение полученной градуировочной зависимости имеет вид:
где у – интенсивность линии при 1750 см–1, отн. ед.; х – концентрация витамина Е на поверхности таблетки KBr, мкл/см2.Для определения предела обнаружения витамина Е на поверхности пробоотборника KBr в соответствии с рекомендациями [12] использовали 3σ-критерий и коэффициент чувствительности из уравнения (1). Значение предела обнаружения витамина Е на поверхности таблетки KBr составило 0.033 мкл/см2.
Для реализации предложенного способа определения витамина Е на поверхности кожи исследовали полноту переноса вещества на поверхность пробоотборника. На зависимость концентрации вещества на поверхности кожи человека от времени влияют трансдермальные свойства кожи и испарение в атмосферу нанесенного вещества с ее поверхности. Для изучения влияния этих факторов провели две серии экспериментов с использованием инертной невпитывающей полиэтиленовой пленки (ПЭ), закрепленной на упругой поверхности, имитирующей кожу. 200 мкл раствора витамина Е в ССl4, содержащего 75 мкл витамина в пересчете на чистое вещество, равномерно наносили на подготовленные поверхности площадью 49 и 81 см2. При этом поверхностная концентрация витамина составила соответственно 1.53 и 0.92 мкл/см2. Пробоотбор на таблетку KBr проводили с поверхности ПЭ сразу после нанесения пленки витамина Е, а также через 20 мин после первого пробоотбора с нового участка поверхности с нанесенным витамином Е. Кроме того, отбирали пробу повторно с участка поверхности ПЭ, с которого уже проводили пробоотбор ранее.
С помощью ИК-Фурье спектрометра регистрировали ИК-спектры витамина Е, перенесенного на таблетку КВr при различных условиях пробоотбора. Результаты эксперимента по пробоотбору витамина Е с поверхности полиэтиленовой пленки с указанием расширенной неопределенности представлены в табл. 2. Как видно, на чистую поверхность таблетки КВr может переходить практически весь нанесенный на кожу витамин Е в точке пробоотбора. Используя предложенный прием пробоотбора, можно контролировать изменения концентрации витамина на поверхности кожи человека. Как видно, в течение 20 мин после нанесения концентрация витамина Е на невпитывающей поверхности не изменяется, т.е. не происходит его интенсивное испарение в атмосферу. Можно предположить, что основным процессом, определяющим изменение концентрации витамина Е на поверхности кожи, является трансдермальный перенос вещества.
Таблица 2.
Результаты эксперимента по переносу витамина Е с полиэтиленовой пленки на таблетку КВr для различных способов пробоотбора
| Способ пробоотбора | Высота пика (1750 см–1), отн. ед. |
Концентрация, мкл/см2 |
|---|---|---|
| Пробоотбор витамина Е сразу после нанесения на ПЭ-пленку (поверхностная концентрация 1.53 мкл/см2) | 1.03 ± 0.05 | 1.45 ± 0.07 |
| Повторный пробоотбор витамина Е с участков поверхности ПЭ-пленки, с которых ранее был выполнен пробоотбор | 0.085 ± 0.004 | 0.018 ± 0.001 |
| Пробоотбор витамина Е через 20 мин после нанесения пленки витамина Е на ПЭ-пленку (начальная поверхностная концентрация 1.53 мкл/см2) | 1.04 ± 0.05 | 1.45 ± 0.07 |
| Пробоотбор витамина Е сразу после нанесения на ПЭ-пленку (поверхностная концентрация 0.92 мкл/см2) | 0.59 ± 0.03 | 0.79 ± 0.04 |
Для изучения скорости изменения поверхностной концентрации витамина Е на коже человека на предварительно обезжиренную путем спиртовой обработки кожу рук на внутренней поверхности локтевого сустава дозатором наносили 200 мкл витамина Е и распределяли равномерно на доступной поверхности кожи, насколько это было возможно в условиях эксперимента. Далее при помощи таблеток KBr с поверхности кожи отбирали витамин Е через определенные промежутки времени и определяли его поверхностную концентрацию методом ИК-Фурье спектрометрии. Таблетки KBr прикладывали к коже на 20 с. С помощью программного обеспечения прибора Iraffinity-1s рассчитывали высоты пиков и строили график зависимости высоты пика, соотносящейся с количеством отобранного вещества, от времени впитывания витамина Е в кожу. На рис. 2 в качестве примера представлена зависимость поверхностной концентрации витамина Е на коже человека от времени для одного из участников исследования. Зависимости для других участников исследования аналогичны. Вопрос о возможности объединения результатов для разных людей пока остается открытым, поскольку предварительно следует оценить влияние увлажненности кожи, типа кожи и других факторов на результаты исследования.
Рис. 2.
Зависимость поверхностной концентрации витамина Е на коже человека от времени, полученная путем измерения высоты характеристического пика при 1750 см–1.
Из зависимости поверхностной концентрации косметического актива от времени видно, что на разных участках скорость трансдермального переноса витамина Е различается, что соответствует различному порядку переноса и другим кинетическим параметрам процесса. Исследование данных вопросов позволит прояснить механизм впитывания витамина Е и других косметических активов. Оценить погрешность определения поверхностной концентрации витамина Е можно, исходя из экспериментов по пробоотбору с поверхности ПЭ-пленки. Для исследуемых поверхностных концентраций относительная стандартная неопределенность составляет около 0.05.
При определении косметических активов на поверхности кожи следует рассмотреть вопрос влияния органических компонентов себума. В работах [13, 14], например, установлено влияние глицеридов жирных кислот на определение альфа-токоферола. Однако авторы отмечают, что предварительное обезжиривание кожи спиртовым раствором позволяет исключить данный фактор, что подтверждается отсутствием дополнительных полос поглощения в ИК-спектрах проб после отбора с поверхности кожи.
Предложенная методика, по мнению авторов, может быть применена для изучения трансдермального переноса других косметических активов, имеющих характеристические колебательные полосы в приведенном диапазоне волновых чисел и низкую летучесть, таких как пептиды, витамины, некоторые поверхностно-активные вещества, гиалуроновая кислота и т.д. При выбранном подходе ИК-Фурье спектрометрия имеет существенные преимущества по сравнению с хроматографическими методиками количественного определения веществ на поверхности кожи и аппаратными методами, дающими скорее качественные, нежели количественные характеристики. Предложенный авторами подход позволяет быстро описать качественный и количественный состав косметического актива. Однако при использовании пробоотборника на основе КВr могут возникнуть трудности, если косметический актив содержится в водной среде. В случае исследования водных растворов и эмульсий возможен вариант применения приставки нарушенного полного внутреннего отражения.
Список литературы
Задымова Н.М. Жидкофазные дисперсные системы как основа микрогетерогенных полимерных матриц для трансдермальной доставки лекарств. Дис. … докт. хим. наук. М.: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова, 2014. 273 с.
Рыжикова В.А. Трансдермальная терапевтическая система бромокаинана основе биосовместимой микроэмульсионной композиции. Дис. … канд. биол. наук. М.: Федер. науч. центр трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова, 2015. 106 с.
Flynn G.L. Physiochemical determinants of skin absorption / Principles of Route-toroute Extrapolation for Risk Assessment / Eds. Gerity T.R., Henry C.J. Amsterdam: Elsevier Science Publishing Co. Inc., 1990. P. 93.
Domeradzka-Gajda K., Nocun M., Roszak J., Janasik B., Quarles C.D., Wasowicz W. A study on the in vitro percutaneous absorption of silver nanoparticles in combination with aluminum chloride, methyl paraben or di-n-butyl phthalate // Toxicol. Lett. 2017. V. 272. P. 38.
Duracher L., Visdal-Johnsen L., Mavon A. In vitro and in vivo dermal absorption assessment of acetyl aspartic acid: a compartmental study // Int. J. Cosmetic Sci. 2015. V. 37. P. 34.
Zeiner M., Cindric I.J., Kandler W., Stingeder G. Trace determination of skin-irritating metals in tea tree oil by GFAAS // Microchem. J. 2018. V. 136. P. 101.
Зуев Б.К., Филоненко В.Г., Нестерович Д.С., Поликарпова П.Д. Определение гиалуроновой кислоты в водных растворах с использованием воздуха как окислителя // Журн. аналит. химии. 2018. Т. 73. № 10. С. 763.
Пеункова Е.С., Зуев Б.К., Моржухина С.В. Изучение распределения органических веществ на поверхности лица методом окситермографии / Семьдесят первая всероссийская научно-техническая конференция студентов, магистрантов и аспирантов высших учебных заведений с международным участием / Под ред. Канакотиной М.А. Ярославль: Издательский дом ЯГТУ, 2018. Ч. 1. С. 253.
Зуев Б.К., Филоненко В.Г., Коротков А.С., Сараева А.Е., Поликарпова П.Д. Пробоотбор и определение гиалуроновой кислоты на имитаторе кожи человека методом окситермографии // Журн. аналит. химии. 2019. Т. 74. № 4. С. 315. (Zuev B.K., Filonenko V.G., Korotkov A.S., Saraeva A.E., Polikarpova P.D. Sampling and determination of hyaluronic acid on a human skin imitator by oxithermography // J. Analyt. Chem. 2019. V. 74. № 4. P. 410.)
Karunaratne D.N., Dassanayake A.C., Geethi K Pamunuwa K.M., Karunaratne V., Improved skin permeability of Dl-α-tocopherol in topical macroemulsions // Int. J. Pharm. Pharm Sci., 2014.V. 6. № 6. P. 53.
Преч Э., Бюльман Ф., Аффольтер К. Определение органических соединений / Пер. с англ. Тарасевич Б.Н. М.: Мир; Бином. Лаборатория знаний, 2006. С. 438.
Основы аналитической химии. В 2-х тт. Т. 1. Учеб. для студ. учреждений высш. проф. образования / Под ред. Золотова Ю.А. М.: Академия, 2012. С. 384.
Valasi L., Arvanitaki D., Mitropoulou A., Georgiadou M., Pappas Ch. Study of the quality parameters and the antioxidant capacity for the FTIR-chemometric differentiation of Pistacia Vera oils // Molecules. 2020. V. 25. P. 1614.
Silva S.D. Rosa N.F., Ferreira A.E., Boas L.V., Bronze M.R. Rapid determination of α-tocopherol in vegetable oils by fourier transform infrared spectroscopy // Food Anal. Methods. 2009. V. 2. P. 120.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Журнал аналитической химии
Пн.-пт.: 10.00-19.00