Агрохимия, 2023, № 4, стр. 51-61

ВВЕДЕНИЕ

Урожайность зерновых культур во многом зависит от качества посевного материала, поэтому оптимизируя регуляторами роста стартовые условия путем предпосевной обработки семян зерновых культур, можно достичь улучшения посевных качеств и урожайности. Важно развивать такие направления в поиске новых технологий предпосевной обработки семян, как выявление наиболее эффективных и экологически безопасных веществ-регуляторов, способов и условий обработки. Изучение данного направления также является актуальным для управления продуктивностью и устойчивостью растений, обоснования энергосберегающих технологий без применения дорогостоящих химикатов. Применение разреженной среды в сочетании с органическими кислотами природного происхождения (образующиеся в растениях в результате естественных физиологических процессов) является одним из малоизученных и перспективных направлений предпосевной обработки семян зерновых культур.

В научных исследованиях изучены биостимулирующая и адаптогенная функции предпосевной обработки семян янтарной и салициловой кислотами. Янтарная кислота активирует дыхание прорастающих зерновок, гидролиз запасных веществ, что может приводить к увеличению активности гидролитических ферментов. Также янтарная кислота может влиять на процесс фотосинтеза. Ее активная форма – сукцинил-S-KoA и гликокол являются непосредственными предшественниками хлорофилла а (протопорфирина). Соответственно, экзогенное поступление янтарной кислоты способствуют биосинтезу хлорофилла и цитохромов. Салициловая кислота в ряде исследований рассматривается как эндогенный многофункциональный биорегулятор, который принимает участие в “клеточном сигналинге”, ростовых процессах, формировании адаптивных реакций растений [2–20].

Однако противоречивые результаты исследований привели к спорам о влиянии обработки семян этими кислотами природного происхождения на рост и развитие растений. Неправильное применение, пренебрежение физиологическими особенностями растений, передозировка кислотами могут не только не дать положительного эффекта, но и вызвать прямо противоположные, отрицательные изменения в организме [3].

Цель работы – исследование влияния и возможности применения в предпосевной обработке семян органических кислот природного происхождения на примере янтарной и салициловой кислот в различных концентрациях на первых этапах роста и развития яровой пшеницы, в том числе в условиях разреженной среды.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были начаты в Учебно-опытном почвенно-экологическом центре МГУ им. М.В. Ломоносова “Чашниково” и продолжены на базе кафедры агрохимии и биохимии растений факультета почвоведения МГУ.

Объектом исследования стали семена яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Радмира. Для предпосевной обработки применяли растворы янтарной (ЯК) и салициловой кислот (СК) в качестве регуляторов роста в концентрациях 10^–3 и 10^–5 М, а также дистиллированную воду (контроль). Опыты проводили без применения и с применением вакуумного инфильтратора (на основе вакуумного насоса DVPLC.4, производства Vacuum Technology Srl, Италия) (рис. 1) с разрежением ~0.9 атм, выбранным как оптимальное, исходя из анализа изученной научной литературы и патентов [11, 12, 14]. Время экспозиции составило 15 мин. Таким образом, получили 10 вариантов лабораторного опыта (табл. 1).

Рис. 1.

Схематическое изображение вакуумного инфильтратора: 1 – кран, 2 – эксикатор (внутри расположены мерные стаканчики с раствором), 3 – крышка эксикатора, 4 – вакуумметр, 5 – вакуумный насос.

В ходе лабораторных опытов использован ГОСТ 12038-84 [17] для определения прорастания семян на 3-и сут проращивания (энергии прорастания), на 7-е сут (всхожести) и морфометричекий метод (для определения ростовых характеристик проростка и длины главного корня).

Кроме лабораторных были проведены вегетационные опыты, в которых семена пшеницы, подверженные обработкам по представленной схеме, высевали в сосуды по 15 шт. Вегетационные сосуды (объемом 1 л) заполняли дерново-подзолистой почвой, доведенной до оптимальной влажности (0.6–0.7 ПВ). Выращивание растений осуществляли в течение 16 сут. Далее биомассу растений в вариантах опыта взвешивали и затем использовали для биохимических анализов определения активности каталазы перманганатометрическим методом Баха [1] и определения устойчивости растений к гипертермии методом Мацкова [11].

Полученные массивы данных были обработаны с помощью методов математической статистики в программе STATISTICA 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения энергии прорастания семян и всхожести было в целом проанализировано 4000 семян пшеницы (4 повторности по 100 семян в повторности и 10 вариантов опыта). Морфометрические показатели проростков семян пшеницы позволили оценить влияние предпосевной обработки семян на ростовые характеристики проростков и длину главного корня в различных условиях опыта (табл. 2).

Анализ результатов длины колеоптиля на 3-и сутки проращивания семян пшеницы показал, что фактор предварительного выдерживания семян в разреженной среде (РС) оказал подавляющее влияние на этот процесс при сравнении контрольных вариантов по предварительной обработке семян с применением разрежения в среде и без такого воздействия. Использование для обработки семян органических кислот как СК, так и ЯК в концентрациях 10^–5 M улучшало ситуацию по угнетающему действию разрежения. Лучшие показатели отмечены для янтарной кислоты как при предварительном выдерживании в РС, так и без такой обработки – относительно контроля произошло увеличение длины колеоптиля на 35 и 15% соответственно.

На 7-е сутки наблюдений за развитием растений (определение всхожести) ситуация изменилась (табл. 2). Сравнение ростовых показателей контрольных семян, выдержанных в разреженной среде и не подвергнутых такой обработке, не отличались (определяющий фактор регулирования роста – наличие или отсутствие РС).

Влияние органических кислот сохранило ту же тенденцию, что и для 3-суточных проростков – положительный эффект, который для концентрации 10^–5 М составил 15 и 53% соответственно для СК и ЯК после воздействия РС. Без обработки разрежением эффект от органических кислот был значительно меньше – 4 и 15% соответственно для СК и ЯК.

Такая же тенденция была показана при обработке данных длины корня на 7-е сутки проращивания. И в этом случае наибольший эффект был получен для ЯК в концентрации 10^–5 М в разреженной среде – увеличение длины корня на 113% (табл. 2).

Для определения статистической значимости факторов обработки семян кислотами в разных концентрациях с применением и без применения фактора разрежения среды был использован дисперсионный анализ средних величин в повторностях. Данные были предварительно преобразованы в натуральные логарифмы. Анализировали фактор влияния обработки разными веществами, фактор применения вакуумной установки и совместное влияние 2-х факторов (рис. 3, 4).

Рис. 2.

Диаграмма размаха показателя длины колеоптиля на 3-и (а) и 7-е (б) сут проращивания (сравнение по фактору 1 – наличие разреженной среды).

Рис. 3.

Диаграмма размаха показателя длины колеоптиля на 7-е сут проращивания (сравнение по фактору 2 – регуляторы роста, органические кислоты).

Рис. 4.

Диаграмма размаха показателя длины корня на 7-е сут проращивания: (а) – сравнение по фактору 1 (наличие разреженной среды), (б) – сравнение по фактору 2 (регуляторы роста, органические кислоты).

Предварительно проводили проверку соответствия средних величин по градациям факторов нормальному распределению (α = 0.05) с применением теста Колмогорова–Смирнова в модификации Лиллиефорса. Было показано, что во всех вариантах опыта, кроме анализа влияния регуляторов роста на 3-и сут, было соответствие распределения нормальному с заданным уровнем значимости. Также с помощью критериев Кохрана, Бартлетта и Хартли было подтверждено условие равенства дисперсий в генеральных совокупностях.

Так как показатели ростовых характеристик семян, полученных на 3-и сут проращивания по градациям фактора “регуляторы роста”, не принадлежали нормальному распределению, был проведен однофакторный дисперсионный анализ только для фактора 1 – разреженная среда (табл. 3). По его результатам можно достоверно говорить о влиянии фактора 1 – наличие или отсутствие влияния разрежения среды.

Результаты измерения длины колеоптиля на 3-и сут проращивания представлены на графике типа boxplot (диаграмма размаха) (рис. 2а). Результаты свидетельствовали о том, что влияние фактора разреженная среда было значимо для длины колеоптиля.

Результаты измерений длины колеоптиля и корня на 7-е сут проращивания резко отличались по своему характеру от результатов, полученных на 3-и сутки проращивания, а именно: варианты опыта с обработкой семян в установке для создания разрежения показали существенное увеличение длины колеоптиля, что подтверждено уровнем значимости, который был получен при дисперсионном анализе (табл. 4, рис. 2б).

Низкие показатели роста при обработке семян СК в большой концентрации можно объяснить накоплением большого количества активных форм кислорода в результате ингибирования каталазы, способной к разложению пероксида водорода и нейтрализации таких реакционных состояний кислорода. Это согласуется с данными работ [4, 18], в которых показано ингибирование действия каталазы при высоких концентрациях экзогенной СК.

Неоднозначные результаты применения разрежения среды, связанные с негативным влиянием на энергию прорастания и существенным возрастанием показателя роста колеоптиля с 3-х по 7-е сут возможно было связано с состоянием “ростового покоя”, который следовал за первичным стрессом от разрежения среды. Показанное резкое увеличение роста свидетельствовало о положительном влиянии разреженной среды, ее синергизме с обработкой семян кислотами, что было выражено в достоверном совместном влиянии 2-х факторов на увеличение длины колеоптиля (табл. 4, рис. 3).

Есть вероятность, что замедление роста колеоптиля в начальный период онтогенеза зависит от уровня разрежения среды и длительности вакуумной обработки, поэтому для уточнения эффекта обработки семян с применением разрежения необходимы дополнительные опыты с другими величинами разрежения и временем экспозиции в разреженной среде.

С целью лучшего понимания эффективности совместного воздействия усилителей роста с применением установки для разрежения среды, были проанализированы однородные группы данных для длины колеоптиля на 7-е сут проращивания, полученные с помощью апостериорного критерия – наименьшей существенной разницы (НСР) Фишера (табл. 5).

Как можно видеть из результатов анализа, разрежение воздушной среды усиливало воздействие ЯК в двух концентрациях и СК в большей концентрации, в то время как в контроле и в варианте воздействия СК в концентрации 10^–5 М с использованием и без использования разрежения полученные данные были почти одинаковыми.

СК в растениях часто рассматривается в качестве стрессового фитогормона. Согласно научным источникам [7, 18], увеличение содержания СК в тканях растения ведет к окислительному стрессу за счет ингибирования фермента каталазы, которая выполняет функцию разложения пероксида водорода на воду и кислород. Такое воздействие вызывает смещение баланса прооксидантов и антиоксидантов в сторону активизации стресс-протекторной системы растений: происходит увеличение активности ферментов, таких как аскорбатпероксидаза и глутатионредуктаза, усиление экспрессии их генов [6]. Также существуют сведения что повышение содержания пероксида водорода в клетках растений индуцирует экспрессию генов, отвечающих за синтез непосредственно защитных белков [16]. Однако конкретные механизмы стресс-протекторных функций могут отличаться в растениях разных видов и в различных условиях [8].

Исходя из этого, в изученных проростках пшеницы было проведено определение активности каталазы перманганатметрическим методом Баха (рис. 5). По полученным результатам можно судить о наиболее сильном ингибировании фермента при обработке салициловой кислотой в концентрации 10^–3 М как для семян, которые выдерживали в вакуумном инфильтаторе (на 40%), так и для не подвергнутых такой обработке (отмечено снижение каталазой активности в листьях растений примерно в 2 раза).

Рис. 5.

Активность каталазы, мг Н₂О₂/г растительной биомассы.

Для анализа связи окислительного стресса, вызванного пероксид-радикалами и резистентности тканей растений к экзогенным стрессорам, было выполнено определение устойчивости побегов яровой пшеницы, семена которой были обработаны аналогично предыдущим опытам, к гипертермии, проведенное по методу Мацкова. В ходе исследования побеги подвергали воздействию температур от 40 до 80°С на водяной бане. Каждый вариант включал по 10 образцов, причем изначальная температура 40°С была выдержана на протяжении 30 мин. Далее при каждом поднятии температуры на 10°С из растений, находящихся в условиях термического стресса, удаляли по 2 образца в каждом варианте, а остальные подвергали воздействию новой температуры в течение 10 мин до следующей итерации. Образцы, изъятые при одной температуре, помещали на пластиковый планшет и обрабатывали 0.2 н. HCl. Затем фиксировали уровень побурения растений во всех вариантах при каждой температуре и, исходя из этого, рассчитывали общий условный балл повреждения в соответствующем варианте (рис. 6).

Рис. 6.

Степень повреждения растений при гипертермии, условные баллы.

Согласно полученным результатам, обработка семян СК в концентрации 10^–3 М в условиях предварительного воздействия разреженной среды в вакуумном инфильтраторе показала самую низкую поврежденность листьев растений после их тепловой обработки, что может быть объяснимо подавляющим влиянием СК на каталазную активность и повышением защитных функций кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обработка семян пшеницы (Triticum aestivum l.) в вакуумном инфильтраторе с разрежением ~0.9 атм, в течение 15 мин вызывала уменьшение энергии прорастания, т.е. было отмечено состояние “ростового покоя”, вызванного разрежением среды (РС). Использование для обработки семян органических кислот как салициловая (СК), так и янтарная кислота (ЯК) в концентрациях 10^–5 M улучшало ситуацию при угнетающем воздействии РС. Лучшие показатели отмечены для ЯК как при предварительном выдерживании в разреженной среде, так и без такой обработки (относительно контроля произошло увеличение длины колеоптиля на 35 и 15% соответственно).

На всхожесть семян (7-е сутки прорастания) оказала существенное влияние обработка органическими кислотами. Наилучшие показатели имели варианты, обработанные СК и ЯК в концентрации 10^–5 М без применения разреженной среды. Положительный эффект от обработки ЯК при концентрации 10^–5 М в условиях РС составил 53 и 15% только с обработкой кислотой, т.е. фактор РС не имел существенного влияния по сравнению с воздействием самой ЯК.

Обработка семян СК в концентрации 10^–3 М в условиях РС дала наилучший результат в условиях гипертермии – снижение повреждения листьев растений после теплового воздействия было на 40% без предварительного использования РС и на 50% при совместном действии РС и СК. Это подтверждено данными по определению активности каталазы, когда обработка СК в концентрации 10^–3 М приводила к наиболее существенному ингибированию фермента, что повышало устойчивость проростков к стрессу.