Агрохимия, 2022, № 3, стр. 68-73

ВВЕДЕНИЕ

Различные виды современного производства (промышленные предприятия, теплоэлектростанции, автотранспорт, добыча полезных ископаемых и др.) являются мощными источниками загрязнения биосферы тяжелыми металлами (ТМ) [1]. Многие из них негативно влияют на живые организмы, и степень этого влияния необходимо оценивать, особенно в случаях, когда это касается вопросов качества продовольствия, например, при производстве сельскохозяйственной продукции [2]. Поглощение ионов ТМ из почвы или питательного раствора корневыми системами и транспорт через мембраны клеток осуществляется разными путями. Ионы ТМ поступают в основном путем пассивной диффузии, а конкуренция ионов в значительной мере может быть предсказана, исходя из их физико-химических характеристик и параметров среды, из которой ионы поступают в растение [3].

Свинец широко распространен в компонентах среды [4], относится к 1-му классу опасности по классификации Международного комитета по проблемам окружающей среды. Вещества этого класса оказывают чрезвычайно вредное воздействие на окружающую среду, самостоятельно не разлагаются. Из атмосферы свинец чаще всего в форме оксидов попадает в почву, где постепенно растворяется, переходя в гидроксиды, карбонаты или катионную форму. Механизм транспорта по ксилеме растений для ионов Pb, Zn, Mg и Co имеет общий характер [5]. По данным литературы, свинец связывается с сульфгидрильными группами ферментов и подавляет их активность или может замещать другие металлы, являющиеся кофакторами важных ферментов, что также приводит к подавлению их активности [6]. Несмотря на имеющиеся в литературе данные, биологическая роль свинца в жизнедеятельности организмов пока не доказана [7].

Кобальт относится к числу металлов c потенциальными мутагенными и канцерогенными свойствами [8], относится ко 2-му классу опасности. Вещества этого класса сильно нарушают экосистему, разлагаются более 30 лет. Вместе с тем в ионной форме Со в живых организмах участвует во многих неспецифических биохимических реакциях (карбоксилирования и декарбоксилирования, гидролиза пептидных связей, гидролиза фосфорных эфиров, переноса фосфатных групп), активируемых Mn, Mg, Zn, Ni, Fe, Ca и может быть заменен ионами этих металлов. Через влияние на ферментные системы кобальт участвует в обмене амидов в растениях, регулирует нуклеиновый обмен, активирует фотохимическую активность хлоропластов, а также стимулирует клеточную репродукцию листьев растений [9]. Кроме того, он участвует в гормональной регуляции [10] и способен усиливать действие ауксина, стимулирующего процессы растяжения и деления клеток.

Сочетанное содержание 2-х или нескольких металлов может оказывать на живые организмы отличные как по силе воздействия, так и его направленности эффекты. Например, при сочетанном действии таких пар металлов как Zn и Со, Сr и Со, Со и Сu в низких концентрациях (n × 10^–6–n × 10^–4 M) на клетки ряски малой (Lemna minor L.) отмечены антагонистические токсические эффекты по сравнению с их индивидуальным воздействием [11], что объясняется физико-химическими свойствами металлов (ионный радиус, степень окисления) и их конкуренцией за места связывания в молекулах и путем поступления в клетку. К сожалению, исследования на сельскохозяйственных культурах (или семенах сельскохозяйственных культур) малочисленны, используемые сочетания элементов носят во многом теоретический характер, а выбранные концентрации в экспериментальных исследованиях не привязаны к реальным загрязнениям хозяйственной сферы [12].

Для снижения негативных последствий действия ТМ все шире применяют препараты, обладающие полифункциональными свойствами и оказывающие влияние не только на ростовые процессы, но и на устойчивость растений к различным стресс-факторам внешней среды [13]. Такие вещества, как правило, обладают физиологической активностью и, различаясь по цели действия и/или способу применения, воздействуют на физиологические и метаболические процессы в растениях, способствуют реализации генетического потенциала и лучшему усвоению питательных веществ. К одним из таких веществ относят кобальтсодержащие удобрения (сернокислый кобальт CoSO₄·7H₂O (20–21%), хлористый кобальт CoCl₂·6H₂O (24.8%), нитрат кобальта Co(NO₃)₂·6H₂O (20.3%) [14] или комплексные удобрения, содержащие кобальт в хелатной форме. Ранее в наших работах [15, 16] были рассмотрены вопросы полиэлементного воздействия ионов ТМ и оценены риски с учетом возможного взаимовлияния металлов и развития процессов синергизма или антагонизма. Однако сведения о том, как действуют ионы свинца в концентрациях, соответствующих разным величинам ПДК, в присутствии ионов кобальта на развитие проростков семян ячменя и цитогенетические показатели в доступной литературе отсутствуют [17].

Цель работы – изучение влияния ионов свинца в различных концентрациях на морфофункциональные и цитогенетические показатели проростков ячменя ярового пивоваренного сорта Жозефин и оценка возможности модификации негативных эффектов за счет влияния ионов кобальта.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования был выбран ячмень яровой (Hordeum vulgare L.), сорт Жозефин (пивоваренный), включенный в Государственный реестр в 2008 г., заявитель – cелекционно-семеноводческая фирма “Secobra Recherches”, Франция.

Токсические агенты – соединения свинца и кобальта. Для оценки токсического действия ионов свинца семена ячменя (по 50 шт.) помещали в чашки Петри и замачивали в 30 мл раствора гидроксида свинца Pb(ОН)₂ в концентрациях, соответствующих 0.1 ПДК для питьевой воды (0.0005 мг/л), 1 ПДК (0.005 г/л), 10 ПДК (0.05 г/л) и 100 ПДК (0.5 г/л). Проращивание семян осуществляли в термостате при температуре 25°С в течение 2-х сут. Таким же образом проводили замачивание семян в растворах гидроксида кобальта Co(OH)₂ в концентрациях 0.001 г/л – 0.1 ПДК, 0.01 г/л – 1 ПДК, 0.1 г/л – 10 ПДК и 1 г/л – 100 ПДК. Для оценки совместного действия ионов металлов раствор для замачивания семян готовили с добавлением гидроксидов свинца и кобальта в концентрациях, соответствующих одним и тем же величинам ПДК для питьевой воды. Повторность опыта четырехкратная.

Эффект воздействия ионов свинца и кобальта на развитие проростков ячменя при их раздельном или совместном присутствии в растворе для замачивания семян определяли по фитотоксическим показателям (морфометрическим – энергии прорастания (ЭП), выраженной как доля семян (%), давших корни, равные половине длины семени, и проростки на 2-е сут проращивания) и цитотоксическим (по частоте аберрантных клеток (ЧАК) – отношении суммы ана- и телофазных клеток, в которых были зарегистрированы нарушения, к общему числу проанализированных ана-телофаз первого деления меристематических клеток корневой меристемы проростков), митотическому индексу (МИ) – доле делящихся клеток (%) от общего числа проанализированных) показателям. Показатели ЧАК и МИ в клетках корневой меристемы проростков ячменя оценивали через 48 ч проращивания семян, когда длина проростков достигала 5–10 мм. Образцы фиксировали в уксусном спирте (3 : 1). Цитогенетический анализ проводили в ана-телофазах на временных давленных препаратах, окрашенных ацетокармином. Давленные препараты просматривали под микроскопом при увеличении ×400. В каждом варианте анализировали от 900 до 1500 ана-телофаз. Влияние ионов металлов на развитие проростков оценивали по отклонению усредненных для варианта величин соответствующих показателей от их величин в контроле, где семена проращивали в дистиллированной воде. Для обработки результатов использовали стандартные статистические методы анализа данных [18]. Для проверки соответствия распределений измеренных параметров нормальному закону применялся критерий Шапиро–Уилка.

Коэффициент антагонизма (АК) рассчитывали по формуле [19]:

где S_Me1 + Me2 – доля аберрантных клеток при совместном действии 2-х металлов за вычетом величины спонтанного фона аберраций (доля аберрантных клеток в контроле), S_Me1 и S_Me2 – доля аберрантных клеток при действии одного из металлов за вычетом величины спонтанного фона аберраций (доля аберрантных клеток в контроле).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Замачивание семян ячменя в растворе, содержащем ионы свинца, приводило к разным по величине эффектам. Отмечено значимое (p < 0.05) снижение энергии прорастания семян и митотического индекса при концентрации ионов свинца в растворах для проращивания, равных 0.1–10 ПДК: при концентрации Pb²⁺ 0.05 г/л (10 ПДК) ЭП уменьшилась в 3.9 раза по сравнению с контролем (рис. 1а), МИ – в 3.8 раза (рис. 1б), ЧАК увеличилась в 9.5 раза (рис. 2). При концентрации ионов свинца 1 г/л (100 ПДК) семена не прорастали вовсе. Установлено [20], что свинец в основном накапливается в корнях растений и негативно влияет на процессы деления клеток, вызывая тем самым хромосомные аберрации. Высокие концентрации металла нарушают процессы фотосинтеза и приводят к выраженному торможению роста и развития проростков ячменя [21].

Cодержание ионов кобальта в растворе для проращивания cемян ячменя вызывало разнонаправленные эффекты в зависимости от концентрации ионов. Например, выраженные фито- и цитотоксические эффекты отмечены при концентрации ионов, соответствующих 10 и 100 ПДК (различия с контролем были значимы при р < < 0.05). Известно, что повышенные концентрации кобальта приводят к токсическим эффектам, которые связаны с развитием окислительного стресса, угнетением процессов ассимиляции и трансляционного аппарата [22]. Цитологический эффект от действия ионов металла можно представить как подавление митоза и повреждение хромосом, о чем свидетельствовали и наши данные. Вместе с тем при проращивании семян ячменя в растворе, содержащем ионы кобальта в концентрации 0.01 г/л (1 ПДК для питьевой воды), их скорость прорастания возрастала на 11.4% (рис. 1а) и достоверно отличалась от контрольных величин. Также увеличился МИ на 32.5% (в контроле МИ составил 8%, а при добавлении в раствор ионов кобальта – 10.6%, рис. 1б), ЧАК оставался на уровне контроля (рис. 2). Можно предположить, что при данной концентрации ионов кобальта происходила активация ферментов, участвующих в матричном синтезе и в синтезе биологически активного вещества – кобаламина, что и приводило к стимулирующим эффектам [9].

Проращивание семян ячменя, в растворе, содержащем одновременно ионы свинца и кобальта, приводило к снижению негативного эффекта, обусловленного повышенным содержанием ионов свинца. Выявлено, что присутствие ионов кобальта в концентрациях 1 и 10 ПДК в растворе совместно с ионами свинца в тех же в концентрациях по ПДК, приводило к значимому повышению ЭП (с 60.3 в варианте Pb²⁺ до 74.3% и с 22.2 до 48.2% соответственно) (рис. 1а). Если при проращивании семян ячменя в растворе, содержавшем Pb²⁺ в концентрации, соответствующей 100 ПДК, отмечено резкое торможение развития проростков (ЭП = 0), то при добавлении ионов кобальта в раствор в концентрации, соответствующей тем же величинам ПДК, ЭП составила 10.1%.

Такая же тенденция к подавлению негативного эффекта, обусловленного ионами свинца при совместном присутствии ионов кобальта, прослежена для показателей МИ и ЧАК. При концентрации ионов металлов, равной 0.1 ПДК, наблюдали незначительное повышение МИ с 6.8% в варианте Pb²⁺ до 7.1% в варианте их совместного присутствия (рис. 1б, 2), но при увеличении концентрации Со²⁺ до 1, 10 и 100 ПДК снижение негативного эффекта ионов свинца было более выраженным и МИ увеличивался в 1.9 и 2.5 раза, при концентрации Pb²⁺ 100 ПДК МИ был равен 1.3%.

Рассчитанные величины коэффициентов антагонизма (по показателям ЧАК) при совместном воздействии ионов свинца и кобальта в концентрациях, равных 0.1–10 ПДК для питьевой воды, составили соответственно 0.19, 0.35 и 0.41.

Показано, что в зависимости от концентрации ионов свинца количество аберрантных клеток увеличивалось, что описывалось уравнением линейной регрессии как в варианте Pb²⁺ (у = 0.2793x + 3.0), так и при совместном содержании свинца и кобальта в растворе для проращивания семян (у = 0.2432x + 1.4), где у – величина ЧАК, а х – концентрация ионов металлов в ПДК для питьевой воды. Коэффициент аппроксимации R² для варианта Pb²⁺ составил 0.71, для варианта (Pb²⁺ + + Со²⁺) – 0.94. При описании дозовых зависимостей линейными уравнениями (у = а + bx) угловой коэффициент b отражал прирост эффекта на единицу концентрации агента. Сравнение угловых коэффициентов b 2-х дозовых зависимостей, полученных для разных типов воздействий, показал, на сколько одно из них более выражено по отношению к другому. Полученные результаты свидетельствовали о том, что при содержании ионов свинца количественный выход аберрантных клеток на единицу концентрации был в 2.14 раза больше по сравнению с совместным присутствием ионов двух металлов.

Одним из источников поступления тяжелых металлов (ТМ) в почву являются агротехнические мероприятия, направленные на повышение урожайности сельскохозяйственных культур (внесение удобрений, пестицидов, использование сточных вод для орошения). В процессе роста растений в зонах деления и растяжения корня отсутствуют физиологические барьеры для передвижения ТМ, поэтому ткани апикального участка накапливают их ионы, что является одной из причин ростингибирующего действия этих химических элементов [23], повреждения ядра [24], нарушения синтеза РНК и ингибирования активности рибонуклеазы [25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты исследования, проведенного на проростках ячменя ярового пивоваренного сорта Жозефин, показали негативное влияние высоких концентраций ионов свинца на скорость прорастания семян, клеточное деление и структуру хромосом. Вместе с тем при совместном присутствии в растворе ионов свинца и кобальта происходило достоверное снижение частоты хромосомных аберраций. Позитивный эффект ионов кобальта, вероятнее всего, был обусловлен увеличением экспрессии генов, контролирующих в клетках апикальной меристемы повышенный синтез белков, подобных лактоферрину или трансферрину, способных инактивировать действие ионов свинца.

Коэффициент антагонизма, рассчитанный по показателю аберрантных клеток при раздельном и совместном присутствии металлов в концентрациях, равных 0.1–10 ПДК для питьевой воды, менялся в пределах 0.19–0.41.

Полученные данные о снижении фитотоксичности одного металла в присутствии другого могут быть использованы в практических целях, а именно при разработке приемов регулирования поступления свинца в растения за счет использования кобальтсодержащих агрохимикатов на различных стадиях развития растений.