Агрохимия, 2022, № 11, стр. 80-93

ВВЕДЕНИЕ

В резолюции V съезда Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (2008 г.) записано: “… обратить внимание на необходимость срочной разработки системы контроля качества и безопасности применения гуминовых препаратов в растениеводстве, животноводстве, медицине и других отраслях”. Многолетний опыт показывает, что центральной проблемой в этом случае является создание стандартных образцов (СО) гуминовых кислот (ГК), извлекаемых из разных почв, торфов, углей и т.п. Только наличие аттестованных СО ГК может решать проблему качества аналитической информации, в первую очередь ее правильности, проблему использования СО ГК в качестве калибровочных и контрольных образцов. Широкое распространение гуминовых препаратов в биологических целях (сельское хозяйство, медицина) требует не только идентификации гуминовых препаратов как гуминовых веществ, но и наличия стабильных образцов с известными биологическими эффектами. Такими образцами также могут стать СО ГК.

Международное гуминовое общество (IHSS) имеет к настоящему времени 6 стандартных (standard) и 5 рекомендуемых (reference) образцов ГК [1], выделенных из речных и озерных вод, почвы, торфа и леонардита. Стандартные образцы отличаются от рекомендуемых более строгими условиями изготовления. В табл. 1 приведены характеристики состава этих образцов.

Ввиду отсутствия ошибок для приведенного элементного состава образцов ГК в целом (в расчете на сухое беззольное вещество) можно отметить следующее: 1 – содержание С варьирует в диапазоне 52.6–63.8% (без леонардита – до 59.5%), 2 – суммарное содержание С, N и Н варьирует в диапазоне 58.1–68.7% (без леонардита – до 66.6%), 3 – сумма всех 6-ти элементов составила от 99.2 до 102.9%, т.е. можно предположить, что ошибка суммы не превышает 3%, 4 – имеется только 2 образца ГК, выделенных собственно из почв.

Помимо калибровочного применения очень важное практическое значение имеет знание реальных ошибок измерения состава гуминовых веществ (в первую очередь углерода и азота), полученных в процессе метрологической оценки и последующей аттестации состава СО ГК. Без знания этих ошибок невозможно статистически достоверно оценить различия в составе ГК в пространстве, во времени, в процессах различных модификаций [2]. Цель работы – получение образца гуминовых кислот из чернозема типичного и оценка его состава с помощью внутри- и межлабораторного эксперимента.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Массу типичного чернозема отбирали на территории многолетнего полевого опыта Почвенного института им. В.В. Докучаева (Курский НИИ АПП), заложенного в 1964 г. на старопахотном участке, в посеве ячменя в 2014 г. с глубины 0–15 см. Площадка отбора 10 × 10 м с координатами северо-западного угла 51°37.047′N 36°15.626′E, северо-восточного угла 51°37.046′N 36°15.629′E, центра площадки 51°37.046′N 36°15.629′E, где N – северная широта, Е – восточная долгота (система позиционирования GPS – Global Position System).

Индивидуальные образцы массой 1–2 кг были отобраны на площадке случайным образом, общая масса почвы составила ≈200 кг. Из общей массы методом квартования получали средний образец массой ≈50 кг, который был использован для выделения гуминовых кислот.

Методика выделения описана в [3]. Для получения одной порции ГК брали навеску среднего образца почвы в 2 кг, декальцировали добавлением 1М HCl до установления в суспензии рН 1.0–2.0, затем добавляли 0.1 М HCl для достижения соотношения почва : раствор = 1 : 10 по массе. Полученную суспензию периодически перемешивали в течение 6 ч, оставляли на ночь, отделяли супернатант декантацией. Декальцированную почву нейтрализовали добавлением 1 М NaOH до рН 7.0, затем добавляли 0.1 М NaOH для достижения соотношения почва : раствор = 1 : 10 по массе. Суспензию периодически перемешивали в течение 6 ч и оставляли на ночь. Через 24 ч после начала щелочной экстракции супернатант отделяли декантацией и центрифугированием (5 мин при 3000 об./мин).

Гуминовые кислоты щелочной вытяжки отделяли от фульвокислот осаждением, подкисляя раствор 6 М HCl до рН 1.0–2.0 и центрифугируя. Осадок ГК вновь растворяли в минимальном объеме 0.1 М KОН, добавляли KCl (до концентрации калия 0.3 М) для коагуляции тонкодисперсных минеральных частиц, осадок отделяли центрифугированием. Далее раствор ГК обрабатывали 0.1 М HCl + 0.3 M HF для осаждения и удаления кремнийсодержащих и других примесей. Полученную суспензию ГК очищали диализом, высушивали на роторном вакуумном испарителе при 40°С. Порошок (черного цвета) переносили в стеклянный тигель и сохраняли в темноте. Всего, таким образом, было получено ≈20 порций ГК. Для сравнения состава порций из каждой из них были отобраны пробы для элементного анализа. Общая масса ГК составила 285 г.

Все процедуры получения образца ГК проведены в отделе биологии и биохимии почв Почвенного института им. В.В. Докучаева.

Из общей массы ГК квартованием был получен средний образец массой 50 г. Этот образец был повторно усреднен квартованием с получением образца массой 3.5 г. Его гомогенизировали перетиранием в агатовой ступке в течение 30 мин, делили на 20 частей по 150 мг, дополнительно высушивали над CaCl₂ и фасовали в склянки из темного стекла, которые хранили с ограничением доступа воздуха в темноте. Склянки вскрывали непосредственно перед элементным анализом.

Оценку зольности препарата ГК проводили только в 3-х лабораториях, которые могли ее определять в микронавесках (ИНЭОС РАН, Почвенный стационар МГУ, ЦКП РУДН), причем разными методами.

Содержание углерода, азота и водорода в образцах ГК определяли на автоматических анализаторах методом сухого сжигания в 11-ти лабораториях разных организаций: Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова (две разные кафедры), Почвенный стационар Факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, Межвузовский центр коллективного пользования МГУ тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МЦКП МТХТ), Центр коллективного пользования РУДН (ЦКП ФХИ), Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН (ИНЭОС), Институт географии РАН (ИГ РАН), Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН (ИОНХ), Российский государственный университет нефти и газа им. И.М. Губкина (РГУ нефти и газа), Институт высокомолекулярных соединений РАН (ИВС), НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА (НИИ ГПЭЧ ФМБА).

Дополнительно на химическом факультете МГУ изучали структурно-групповой состав (методом ЯМР) и оптические свойства ГК. Спектры ¹³С ЯМР регистрировали на приборе “Avance 400” при рабочей частоте 100 МГц и ширине развертки спектра 425 м.д., применяя импульсную последовательность CPMG со временем регистрации сигнала спада свободной индукции (ССИ) 0.2 с, релаксационной задержкой 7.8 с и шириной первого импульса 90°. Для исключения ядерного эффекта Оверхаузера широкополосная развязка от протонов была включена во время регистрации сигнала и выключена во время релаксационной задержки (импульсная техника INVGATE). Время регистрации спектра порядка 12 ч. Интервал времени релаксации выбран в соответствии с предшествующими исследованиями [4], показавшими, что интервалы между импульсными последовательностями порядка 8 с обеспечивают полную релаксацию четвертичных атомов углерода в гуминовых веществах. Навеску препарата ≈40 мг растворяли в 0.6 мл 0.3 М NaOD/D₂O и переносили в 5-мм ампулу для ЯМР.

Умножение сигналов ССИ на спадающую экспоненту с оптимальной для ЯМР-анализа ГК константой времени LB 100 гц, их Фурье-преобразование, фазирование преобразованных спектров и коррекцию базовой линии осуществляли при помощи программного обеспечения “MestRec”. Преобразованные спектры интегрировали по 9-ти интегральным интервалам, соответствующим основным структурным группам ГК [4].

Оптические свойства ГК исследовали методом спектрофотометрии в области поглощения ароматических колец (254 нм) при рН 6.8. Рассчитывали две характеристики: SUVA₂₅₄ (оптическая плотность, нормированная на концентрацию органического углерода и длину оптического пути [5] и Е₄/Е₆ (отношение оптических плотностей при длинах волн 465 и 665 нм, что является характеристикой степени гумификации [6]).

Для статистического анализа результатов использовали параметрические и непараметрические методы согласно [7]. Доверительные интервалы для медианы оценивали по [8, 9].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рассмотрим сначала результаты элементного анализа проб из 14-ти исходных порций ГК до их усреднения, выполненного в двукратной повторности в одной лаборатории химического факультета МГУ (табл. 2).

Для получения обобщенной картины были использованы метод построения дендрограмм сходства объектов и метод главных компонент с учетом всех 3-х определяемых элементов. Эти методы показали, что выборка распадается на 2 основные группы порций и 2–3 отстоящих от них порции (и для исходных данных, и для средних из 2-х повторностей) (рис. 1а). Из табл. 2 видно, что одной из наиболее выделяющихся является 12-я порция с максимальным содержанием С. Этот результат многомерного рассмотрения подтвердился и при построении плотностей распределения отдельных показателей (методом прямоугольных вкладов сглаживания гистограмм [10]) (рис. 1б). Показано, что ни по одному элементу нет даже унимодального распределения, не говоря уж о симметричном или нормальном. Поэтому характеризовать эти выборки имеет смысл непараметрически, через медианы и квантили (табл. 3). Однофакторный дисперсионный анализ также показал различия между собой порций ГК в целом при уровнях значимости 0.01 для С и Н и 0.05 – для N.

Рис. 1.

Расположение 14-ти объектов (табл. 2) (в поле указаны их номера), охарактеризованными средними содержаниями С, Н, N – (а). По вертикали – 2-я главная компонента с долей общего варьирования 41%. Плотности распределения С, Н, N для выборки из 14-ти исходных порций ГК – (б).

Исследование элементного состава усредненного образца ГК сначала было проведено также в одной лаборатории химфака МГУ в 2-х вариантах: 1 – от всей массы отбирали 21 пробу по 1 мг, которые анализировали один раз, 2 – от всей массы отбирали 12 проб по 1 мг и каждую анализировали 4 раза. Результаты первого варианта представлены в табл. 4, второго – в табл. 5.

Анализ табл. 4 методами построения дендрограммы сходства и главных компонент показал, что близость измерений по совокупности 3-х элементов невысока (на уровне сходства 50% выявилось 5 групп проб, рис. 2а), но отбраковать какую-то конкретную пробу не представлялось возможным, т.к. выпадающие крайние показатели содержаний С и Н принадлежат разным пробам. Такую сложную ситуацию подтвердило и построение графиков плотности распределения (рис. 2б), из которых видно, что только для N получено унимодальное распределение, а для С и Н выборка распадается на две части. Поэтому и ее охарактеризовали непараметрически (табл. 3). В случае азота можно дать приближенную оценку стандартного отклонения как половины размаха квантилей при вероятности 68.3% – получается 0.14% (это совпадает с доверительным интервалом для медианы).

Рис. 2.

Дендрограмма сходства проб ГК (табл. 4) по совокупности содержания С, Н, N – (а). Горизонтальная линия проведена на уровне сходства 50%. Номера проб сверху соответствуют табл. 4. Плотности распределения С, Н, N для выборки из 21-й пробы усредненных ГК в одной повторности – (б).

Выборка табл. 5 еще более представительна, т.к. содержит повторные измерения проб. Однако полученная при комплексном анализе картина принципиально не отличалась от предыдущей (рис. 3а), на уровне сходства 50% выявили 3 группы проб. И это несмотря на то что однофакторный дисперсионный анализ не показал различий между пробами (при уровне значимости 0.05) для каждого из 3-х элементов, т.е. разброс данных в целом соответствовал разбросу, связанному с повторностями – стандартные отклонения были равны 0.35% (С), 0.16% (Н), 0.13% (N). Последняя величина практически совпадает с указанной выше для выборки табл. 4. Однако более тонкое сопоставление с помощью величины НСР₀₅ и попарных сравнений средних по t-критерию показало, что имеется ≈10 случаев (особенно для С и N), когда средние из повторений различались. Это объясняет распадение распределений выборки на 2 части для углерода и водорода (рис. 3б) и на несколько групп по совокупности 3-х элементов (рис. 3а). Непараметрические характеристики этой выборки представлены в табл. 3. Оценка стандартного отклонения для N дала величину 0.145%, что близко вышеуказанным оценкам.

Рис. 3.

Дендрограмма сходства 12-ти проб ГК для средних С, Н, N – (а). Горизонтальная линия соответствует уровню сходства 50%. Сверху указаны номера проб в табл. 5. Плотности распределения С, Н, N для выборки из 12-ти проб усредненных ГК в четырехкратной повторности – (б).

Напомним, что все вышеприведенные измерения элементного состава ГК были проведены в одной лаборатории химфака МГУ на одном анализаторе. Могло быть 2 причины полученной бимодальности плотностей распределения и разделений выборок проб ГК на группы: недостаточное усреднение массы ГК и неоднородность условий самого элементного анализа на автоматическом анализаторе. Из рисунков 1а–3а и табл. 3 следует, что после усреднения исходных порций ГК характеристики распределения стабилизируются, и размах варьирования уменьшается (кроме азота), варьирование имеет место во второй–третьей значащей цифре. Отсюда можно предположить, что сохраняющаяся при усреднении массы ГК бимодальность связана скорее всего с неоднородностью условий элементного анализа.

Теперь рассмотрим межлабораторный эксперимент по элементному анализу усредненной массы ГК в 11-ти разных лабораториях (табл. 6). Многомерный взгляд (С, Н, N совместно) на полученный массив данных (дендрограмма сходства и метод главных компонент) (рис. 4а) показал (как по отдельным измерениям, так и после усреднения повторностей), что данные расположены довольно рыхло (доли от среднего для размахов показателей составили 13% для С, 78% – для Н, 90% – для N), результаты разных лабораторий почти не пересекаются, но и нет явных показаний к тому, чтобы отбраковать результаты какой-то лаборатории.

Рис. 4.

Дендрограмма сходства средних С, Н, N по лабораториям межлабораторного эксперимента – (а). Горизонтальная линия обозначает уровень сходства 50%. Наверху указаны номера лабораторий. Плотности распределения С, Н, N для выборки усредненных проб ГК (Н и N после отбраковки по одной лаборатории) из 11-ти лабораторий – (б).

Однофакторный дисперсионный анализ показал (в отличие от предыдущих экспериментов) очень значимые различия средних содержаний элементов между лабораториями. Правда, этот вывод недостаточно надежен, т.к. тут явно не выполнена предпосылка дисперсионного анализа о равенстве дисперсий в лабораториях (последние различались на порядок и более). В то же время можно отметить, что несмотря на большой разброс данных, все распределения были унимодальны (в отличие от описанной выше ситуации). Непараметрические оценки характеристик распределений для элементов показаны в табл. 3.

Более подробное рассмотрение разброса средних для лабораторий показало, что для содержания С нет оснований браковать какую-либо лабораторию, для содержания Н можно отбраковать данные ИОНХ РАН (очень большие величины), а для содержания N – данные ИВС РАН (очень маленькие величины). После такой отбраковки средние для лабораторий для Н и N продолжали значимо различаться (дисперсионный анализ), хотя и слабее, а характеристики разброса данных сузились (табл. 3). На рис. 4б показаны графики соответствующих плотностей распределений (для Н и N после отбраковки).

Проанализируем полученные результаты оценок содержания С, Н, N в усредненном образце ГК, предназначенном для того, чтобы стать стандартным образцом. В такой ситуации на первое место выходит характеристика правильности (“степень близости между полученным результатом и истинным значением” [11]), так как характеристики варьирования могут быть уменьшены увеличением числа повторных измерений. Для характеристики стандартных образцов наиболее предпочтительно использовать несколько методов, а также привлечение нескольких лабораторий [12], поэтому будем далее опираться на результаты межлабораторного эксперимента.

Для содержания углерода межлабораторная оценка медианы почти на 4% абсолютных меньше внутрилабораторной, причем меньше и квантильные интервалы. Для содержания водорода, наоборот, межлабораторные оценки больше примерно на 0.5% абсолютных. Лучше ситуация с содержанием азота – межлабораторная оценка медианы больше всего на 0.1% абсолютных, но все внурилабораторные квантильные интервалы лежат внутри межлабораторных. Напомним, что только для азота распределения для усредненного образца ГК во всех случаях были унимодальными.

Чтобы сопоставить наши результаты с составом ГК Международного гуминового общества (табл. 1), понадобились дополнительные пересчеты их результатов от сухого беззольного вещества на вещество с золой и гигроскопической влагой. Тогда получаем для нашего образца ГК сумму (С + Н + N) = 57.8%, в стандартных образцах из почв Elliot – 60.0–61.2%, в рекомендуемом образце из почвы Summit Hill – 58.0%. С учетом ошибок пересчета и измерения эти величины близки; для остальных образцов ГК из табл. 1 (из рек, озер, торфов) эта величина меньше.

Зольность ГК определяли только в 3-х лабораториях (табл. 7), что связано с техническими причинами – возможностью определять зольность в микронавесках. Из табл. 7 видно, что 2 лаборатории получили сравнительно близкие результаты, а одна – значительно и значимо меньше. Из-за малого числа лабораторий вопрос об отбраковке не стоял, и были использованы непараметрические оценки с ожидаемо большой ошибкой для медианы (табл. 3).

Определение структурно-группового состава ГК провели методом спектроскопии ¹³С ЯМР. Интегрирование спектров осуществляли при помощи программного обеспечения “Geltreat”, разработанного А.В. Кудрявцевым. Спектры интегрировали по 9-ти интервалам, соответствующим основным структурным группам согласно табл. 8 [13]. Полученные нами результаты представлены в табл. 9.

Из табл. 9 можно видеть очень высокую долю ароматического углерода (свыше 50% от общего). Такой структурно-групповой состав характерен для ГК чернозема [3] и свидетельствует о высокой гидрофобности образца ГК, что важно с позиций структурообразующей роли гуминовых веществ в почве.

Спектр оптического поглощения раствора из образца ГК, снятый в диапазоне 200–800 нм при рН 6.8, характеризовался плавным снижением оптической плотности с ростом длины волны и отсутствием выраженных пиков, что типично для спектров поглощения гуминовых веществ. При концентрации ГК в растворе 6.4 мг/л (53.2% С) получено: SUVA₂₅₄ 0.122 л/(мг см), Е₄/Е₆ 3.89. Величина SUVA₂₅₄ была близкой к верхней границе исследованных ранее ГК [13].

ВЫВОДЫ

1. Из пахотного чернозема типичного Курской обл. выделен образец гуминовых кислот (ГК), предназначенный для аттестации его в качестве стандартного образца.

2. Оценено содержание углерода, водорода, азота на автоматических анализаторах методом сухого сжигания. Медианы межлабораторной оценки составили для С 50.8%, Н – 3.6%, N – 3.3% (на сухое вещество с гигроскопической влагой).

3. Определены зольность образца ГК (медиана 2.1%), содержание структурных групп методом ¹³С ЯМР (ароматического углерода >50%), оптические характеристики поглощения.