РАДИОХИМИЯ, 2022, том 64, № 6, с. 568-572

УДК 546.110.23:547.15/17

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННОГО ДЕЙТЕРИЕМ

β -АЛАНИЛ-L-ГИСТИДИНА ИЗОТОПНЫМ

ОБМЕНОМ

Н. Ф. Мясоедов^а, С. Л. Стволинскийб,**

^а Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский

институт», 123182, Москва, пл. Курчатова, д. 2

^б Научный центр неврологии, 125367 Москва, Волоколамское шоссе, д. 80.

e-mail: *nagaev@img.ras.ru, **slstvolinsky@mail.ru

Поступила в редакцию 28.07.2022, после доработки 20.09.2022, принята к публикации 27.09.2022

Проведено сравнение эффективности изотопного обмена при использовании в качестве источника

дейтерия газообразного дейтерия (без использования растворителя, твердофазный обмен) и

дейтериевой воды. Установлено, что для получения меченого β-аланил-L-гистидина предпочтителен

обмен с дейтериевой водой. При использовании твердофазного метода основная часть метки находится

в гистидине. Распределение дейтерия при изотопном обмене с D₂O получается более равномерным.

Кроме того, использование дейтериевой воды позволяет уменьшить количество немеченого изотопомера

до 0.4% и получить препарат с выходом 40% (20 мг) и средним содержанием 3.6 атома дейтерия на

молекулу карнозина. Можно предположить, что высокий выход и большее включение дейтерия связаны

с предварительной обработкой реакционной смеси газообразным дейтерием.

Ключевые слова: β-аланил-L-гистидин (карнозин), дейтерий, синтез, меченые соединения.

DOI: 10.31857/S0033831122060107, EDN: MGJORG

Природный дипептид β-аланил-L-гистидин (кар-

Кроме того, карнозин ингибирует рост амилоид-

нозин) содержится в больших количествах в ске-

ных фибрилл, которые образуются, например, при

летных мышцах позвоночных животных и в малом

болезни Альцгеймера. Также считается, что этот

количестве присутствует в мозге и сердце.

пептид обладает некоторыми функциями молеку-

лярного шаперона, а известно, что главная функция

этой системы состоит в восстановлении правильной

нативной третичной или четвертичной структуры

белка, а также образовании и диссоциации белко-

вых комплексов [2]. Нейропротекторное действие

карнозина охарактеризовано в различных in vitro и

В возбудимых тканях животных карнозин явля-

in vivo моделях патологий центральной нервной си-

ется хелатором ионов металлов, рН-буфером, а в

стемы [3, 4]. Однако, несмотря на многочисленные

условиях окислительного стресса выполняет функ-

убедительные экспериментальные данные, а также

ции гидрофильного антиоксиданта - перехватчика

ряд успешных проектов, связанных с применением

радикалов, а также индуктора эндогенных антиок-

карнозина при некоторых хронических заболева-

сидантных систем, проявляет способность защи-

ниях, широкого выхода в практическую медицину

щать ткани от образования конечных продуктов пе-

лекарственные формы на основе карнозина не по-

рекисного окисления липидов, карбонилирования

лучили [4, 5]. Одним из основных препятствий при-

нуклеиновых кислот и гликирования белков [1].

менения карнозина в качестве фармакологического

568

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННОГО ДЕЙТЕРИЕМ β -АЛАНИЛ-L-ГИСТИДИНА

569

Рис. 1. Масс-спектры меченного дейтерием карнозина. (а) - спектр в отрицательных ионах (соответствующий молекуляр-

ному пику [M-H]^-); фрагмент спектра с m/z 226-232 соответствует изотопомерам карнозина; (б) - спектр фрагментации

молекулярного пика [M-H]^-@35 эВ. Фрагмент с m/z 154-159 соответствует изотопомерам гистидина.

средства является необходимость использования

В качестве меченого аналога биологически ак-

высоких доз препарата из-за его быстрого гидроли-

тивных соединений часто целесообразно исполь-

за присутствующим в крови высокоспецифичным

зование изотопов водорода. Тритиевые соединения

ферментом - сывороточной карнозиназой. При

дают информацию о включении в объект исследо-

этом оценка биодоступности экзогенного карнози-

вания и об устойчивости препарата в различных

на затруднена наличием в тканях фермента карно-

биологически активных средах. Но, для каждого

зинсинтетазы, восстанавливающего дипептид из

нового препарата необходима отработка условий

пула β-аланина и L-гистидина. В связи с этим для

включения метки и установка ее распределения

оценки поступления экзогенного карнозина в ор-

между фрагментами, из которых состоит вещество.

ган-мишень представляет интерес внесение метки

Только в этом случае можно рассчитать соотноше-

в аминокислоты в составе молекулы дипептида,

ние метаболитов в получаемых пробах. Поэтому

что может способствовать оценке вклада в наблю-

предварительная отработка методики изотопного

даемое терапевтическое (профилактическое) дей-

обмена на дейтерии может быть полезна при реше-

ствие ресинтезированного карнозина.

нии обеих этих задач.

РАДИОХИМИЯ том 64 № 6 2022

570

ШЕВЧЕНКО и др.

Таблица 1. Условия получения меченого карнозина изотопным обменом с D₂ и содержание различных изотопных

форм во всем пептиде и в гистидине (D₂, 5% Pd/Al₂O₃, Al₂O₃)

Среднее содержание дейтерия в молекуле (D_ср)

Количество

Температура,

Время,

Выход,

и % молекул, содержащих X атомов дейтерия (D_X) в смеси

смеси

°С

мин

изотопомеров: во всем пептиде/в гистидине

(пептида), мг

D_ср

D₀

D₁

D₂

D₃

D₄

D₅

D₆

D₇

160

6.0

(0.18)

1.3

21.1/25.5

59.7/64.2

15.1/9.6

3.3/0.6

0.8/0.1

0/0

200

6.5

(0.20)

1.62

13.2/14.5

49.1/55.4

19.1/19.4

6.4/10.5

6.4/0.2

5.0/0

0.8/0

0/0

220

7.0

(0.21)

Таблица 2. Условия получения меченого карнозина изотопным обменом с D₂О и содержание различных изотопных

форм во всем пептиде

Среднее содержание дейтерия в молекуле (D_ср) и % молекул

Количество

Выход,

Температура, °С

Время, ч

изотопомера, содержащегося в пептиде

пептида, мг

D_ср

D₀

D₁

D₂

D₃

D₄

D₅

D₆

D₇

100

1.02

7.3

83.0

9.8

0.1

0.05

1.59

3.9

46.9

38.2

9.6

1.7

120

2.70

0.8

8.8

30.2

41.5

17.4

1.2

0.2

3.05

125

2.85

Целью данной работы является отработка усло-

рость подачи элюента 20 мл/мин. Время удержива-

вий включения дейтерия в карнозин, желательно с

ния карнозина 2.66 мин.

включением более двух атомов дейтерия, и оценка

Масс-спектрометрические данные получали

распределения дейтерия между β-аланином и L-ги-

на приборе LCQ Advantage MAX (ThermoElectron,

стидином.

США) с ионизацией электрораспылением, пря-

мым вводом раствора образца с концентрацией

10 мкг/мл в метаноле и дальнейшей фрагмен-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

тацией группы изотопомеров с m/z в диапазо-

не 226-233, соответствующих однозарядному мо-

Катализаторы, растворители, реагенты и карно-

лекулярному пику [M-H]^-, в анализаторе методом

зин - коммерческие препараты. Дейтерированные

ионных соударений при 35 эВ. Содержание дейте-

соединения охарактеризованы с использованием

рия в гистидине определяли по фрагменту, соот-

метода высокоэффективной жидкостной хромато-

ветствующему моноизотопному пику с m/z 154.1

графии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии. ВЭЖХ про-

в диапазоне массовых чисел 154-160 (рис. 1).

водили на колонке Reprosil pur Diol (3 × 150 мм, раз-

Расчет распределения изотопомеров проводили в

мер частиц 5 мкм). Температура колонки 30°С. Дли-

соответствии с методом, описанном в работе [6].

на волны 220 нм. Элюент А - ацетонитрил (AcN)-

Изотопный обмен проводили по методике [7].

10 мМ NH₄OH (1 : 1), элюент Б - AcN, линейный

градиент от 80 до 50% Б за 10 мин. Скорость подачи

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

элюента 1 мл/мин. Время удерживания карнозина

7.98 мин.

Для работы с газообразным дейтерием раствор

Препаративную очистку проводили ВЭЖХ с

50 мг карнозина в 0.5 мл воды наносили на 1500 мг

использованием колонки Reprosil pur C18aq (20 ×

Al₂O₃ и при перемешивании замораживали жидким

150 мм, размер частиц 10 мкм). Температура колон-

азотом. Затем смесь лиофилизировали. Сухой оста-

ки 25°С. Длина волны 226 нм. Элюент А - 10 мМ

ток смешивали с 100 мг 5% Pd/Al₂O₃.

NH₄OAc, элюент Б - метанол, программа градиента

В реакцию брали аликвоту смеси, помещали в

0 мин - 0% В, 5 мин - 0% В, 15 мин - 20% В. Ско- реакционную ампулу и нагревали до 160-220C в

РАДИОХИМИЯ том 64 № 6 2022

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННОГО ДЕЙТЕРИЕМ β -АЛАНИЛ-L-ГИСТИДИНА

571

Таблица 3. Введение дейтерия в карнозин в препаратив-

Методика, при которой в качестве изотопного

ных количествах (D₂О, 125С, 24 ч, 5% Pd/Al₂O₃, Al₂O₃)

источника используется D₂О, является более пер-

∑D

спективной, так как при ее применении дейтерий

включается и в β-аланиновый фрагмент пептида.

3.59

1.72

При этом количество изотопомера, не содержащего

Изотопомеры

дейтерий, резко уменьшается.

D₀

0.4*

D₄

40.9*

D₀

0.3**

D₄

1.9**

Так как дейтерированных соединений, как пра-

D₁

1.7

D₅

10.9

D₁

39.6

D₅

вило, требуются десятки миллиграмм, увеличение

D₂

9.8

D₆

2.7

D₂

49.7

D₆

выхода и/или содержания дейтерия в веществе яв-

D₃

32.8

D₇

0.8

D₃

8.5

D₇

ляется весьма желательным. Поэтому для дополни-

тельного повышения содержания дейтерия в кар-

* Содержание дейтерия в карнозине,

** содержание дейтерия в гистидине.

нозине реакцию изотопного обмена с дейтериевой

водой проводили после обработки сухой реакцион-

течение 10-20 мин (табл. 1). Реакционную ампулу

ной смеси D₂ (табл. 3). Расчет состоял в том, что

вакуумировали и заполняли дейтерием до давления

удастся заменить протий, содержащийся в реакци-

400 гПа. Вещество смывали с катализатора метано-

онной среде, на дейтерий и уменьшить изотопное

лом (3 × 1 мл). Фильтраты упаривали, остаток рас-

разбавление, а также можно будет использовать

творяли в 0.5 мл метанола. Анализ показал, что вы-

способность молекулярного водорода создавать

ход меченого препарата равнялся 5-45% (табл. 1).

кислотные центры на активных центрах катали-

После очистки методом ВЭЖХ водный раствор кар-

затора [D⁺(D₂O)_n]. Квантово-химические расчеты

нозина лиофилизировали. Содержание изотопоме-

показывают обоснованность влияния [D⁺(D₂O)_n] на

ров изучали с использованием масс-спектрометрии.

увеличение изотопного обмена [8]. Повышение эф-

фективности изотопного обмена между молекула-

При использовании D₂O раствор 150 мг карно-

ми вещества и D₂О в атмосфере водорода показано

зина в 2 мл дейтериевой воды смешивали с 150 мг

в ряде публикаций [9-13].

Al₂O₃ и 15 мг 5% Pd/Al₂O₃. В опыт брали от 5 до

50 мг карнозина, реакцию вели от 3 до 24 ч при тем-

Для реализации этих изменений в методике экс-

пературе 100-125C, выход - от 40 до 72% (табл. 2).

перимента раствор 50 мг карнозина в 0.5 мл D₂O

смешивали с 500 мг Al₂O₃ и 5 мг 5% Pd/Al₂O₃.

Смесь лиофилизировали. Сухой порошок дваж-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ды обрабатывали в течение 10 мин газообразным

дейтерием (400 гПа) при 70C для более быстрого

При проведении реакций без растворителя ока-

обмена подвижного протия на дейтерий и дважды

залось, что проводить их при температурах выше

вакуумировали для удаления протий-дейтериевой

200C нецелесообразно. При этом среднее вклю-

газовой смеси. К смеси добавляли 0.7 мл D₂O, пе-

чение дейтерия остается в районе 1.5 атомов. Из-

ремешивали и замораживали жидким азотом. При

вестно, что при масштабировании эксперимента

охлаждении жидким азотом из ампулы вакуумиро-

включение изотопа, как правило, падает [6]. Еще

ванием удаляли остаток водорода и доводили дав-

один недостаток этой методики в том, что остается

ление в ампуле до атмосферного аргоном. Ампулу

большое количество недейтерированного вещества.

запаивали и выдерживали сутки при 125С.

Последнее обстоятельство может негативно влиять

Данная методика, во-первых, позволила умень-

на использование [D]карнозина в качестве стандар-

шить количество недейтерированного вещества до

та для масс-спектрометрии.

0.4%. Во-вторых, содержание дейтерия в гистидине

Также при проведении реакций без растворителя

уменьшилось до 45-48%, т.е. распределение дей-

оказалось, что основная часть дейтерия включается

терия в карнозине по аминокислотам стало прак-

в гистидин. При этом с повышением температуры

тически равномерным. В-третьих, удалось с выхо-

распределение дейтерия становится более равно-

дом 40% (20 мг) получить препарат, содержащий

мерным (160C - 83%, 180C - 78% дейтерия в ги-

3.59 атома дейтерия на молекулу, что позволило

стидине).

выполнить все поставленные перед работой задачи.

РАДИОХИМИЯ том 64 № 6 2022

572

ШЕВЧЕНКО и др.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Artioli G.G., Sale C., Jones R.L. // Eur. J. Sport Sci.

2019. Vol. 19, N 1. P. 30-39.

https://doi.org/10.1080/17461391.2018.1444096

Работа была проведена при поддержке темы

Chik J.K., Vande Graaf J.L., Schriemer D.C. // Anal.

№1021052806528-6-1.6.4;3.1.1;3.1.9;3.1.8;3.2.25 «Фун-

Chem. 2006. Vol. 78, N 1. P. 207-214.

даментальные аспекты нейропластичности в рам-

https://doi.org/10.1021/ac050988l

ках модели трансляционной неврологии».

Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Мечен-

ные тритием липофильные соединения. М.: Наука,

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

2003. 246 с.

Борисов Ю.А., Золотарев Ю.А. // ЖФХ. 2002. Т. 76,

№ 4. С. 734-738.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта ин-

Esaki H., Ito N., Sakai S., Maegawa T., Monguchi Y.,

тересов.

Sajiki H. // Tetrahedron. 2006. Vol. 62, N 47. P. 10954-

10961.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

https://doi.org/10.1016/j.tet.2006.08.088

10. Lockley W.J.S., Hesk D. // J. Label. Compd. Radiopharm.

Болдырев А.А. // Биохимия. 2012. Т. 77, № 4. С. 403-

2010. Vol. 53, N 11-12. P. 704-715.

418.

https://doi.org/10.1002/jlcr.1815

Bellia F., Vecchio G., Cuzzocrea S., Calabrese V.,

11. Maegawa T., Fujiwara Y., Inagaki Y., Esaki H.,

Rizzarelli E. // Mol. Aspects Med. 2011. Vol. 32. N 4-6.

Monguchi Y., Sajiki H. // Angew. Chem. Int. Ed. 2008.

P. 258-266.

Vol. 47, N 29. P. 5394-5397.

https://doi.org/10.1016/j.mam.2011.10.009

https://doi.org/10.1002/anie.200800941

Boldyrev A.A., Aldini G., Derave W. // Physiol. Rev.

12. Sajiki H., Hattori K., Aoki F., Yasunaga K., Hirota K. //

2013. Vol. 93, N 4. P. 1803-1845.

Synlett. 2002. N 7. P. 1149-1151.

https://doi.org/10.1152/physrev.00039.2012

https://doi.org/10.1055/s-2002-32605

Menon K., Mousa A., de Courten B. // BMJ Open. 2018.

13. Sajiki H., Aoki F., Esaki H., Maegawa T., Hirota K. //

Vol. 8. N 3.

Org. Lett. 2004. Vol. 6, N 9. P. 1485-1487.

https://doi.org/10.1136/bmjopen-2017-020623

https://doi.org/10.1021/ol0496374

РАДИОХИМИЯ том 64 № 6 2022