БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 3, с. 581-586

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3

ДЕЙСТВИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С ЛИГАНДОМ

НА ОСНОВЕ N-АЦЕТИЛ-L-ЦИСТЕИНА ПРИ СУБЛИНГВАЛЬНОМ

ВВЕДЕНИИ ЭТИХ КОМПЛЕКСОВ В ОРГАНИЗМ КРЫС

*Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии имени академика Е.И. Чазова Минздрава

России, 121552 Москва, 3-я Черепковская ул., 15а

**Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы

биотехнологии» Российской академии наук, 119071 Москва, Ленинский просп., 33/2

***Физический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

119991 Москва, Ленинские горы,1/2

E-mail: timoshin_a_a@mail.ru

Поступила в редакцию 16.03.2022 г.

После доработки 16.03.2022 г.

Принята к публикации 18.03.2022 г.

Проанализировано действие такой стабилизированной формы NO, как динитрозильные

комплексы железа с лигандом на основе N-ацетил-L-цистеина, при сублингвальном введении

данного соединения в организм крыс. Методом ЭПР установлено, что в результате его введения в

ткани печени регистрируется образование и накопление комплексов динитрозильные комплексы

железа с белковыми лигандами. Кроме того, в результате действия динитрозильных комплексов

железа с N-ацетил-L-цистеином регистрируется достоверное увеличение общего уровня NO в

ткани сердца и печени, причем наиболее существенный эффект установлен для печени животного.

Ключевые слова: N-ацетил-L-цистеин, динитрозильные комплексы железа, оксид азота, спиновая

ловушка, сублингвальное введение, электронный парамагнитный резонанс.

DOI: 10.31857/S0006302922030188, EDN: APOAII

ленных условиях для их последующего введения в

Известно, что динитрозильные комплексы

организм. Ранее нами в работах [15, 16] были

железа (ДНКЖ) с тиол-содержащими лигандами

являются одной из основных природных форм

представлены данные о действии ДНКЖ с глута-

тионовыми лигандами (ДНКЖ-Глт) при различ-

депонирования NO в биосистемах [1-9]. Такие

ных способах введения этого комплекса в орга-

стабилизированные формы NO обеспечивают пе-

низм. Установлено, что формирование ДНКЖ с

ренос и накопление NO в организме, а в результа-

белковыми лигандами в крови и их гипотензив-

те их распада происходит высвобождение NO, S-

нитрозотиолов и ионов двухвалентного железа [7,

ное действие регистрируются в тех случаях, когда

ДНКЖ-Глт вводился в организм путем инъек-

8]. Известно также, что ДНКЖ обладают соб-

ции, а именно внутривенно, подкожно, внутри-

ственным антиоксидантным и цитопротектор-

брюшинно и внутримышечно.

ным действием [4, 10-13], а также могут являться

природным регулятором уровня NO в органах и

В данной работе предпринята попытка анали-

тканях [14].

за биологической активности препарата ДНКЖ,

в котором тиолсодержащим лигандом является

Известно также, что ДНКЖ с низкомолеку-

N-ацетил-L-цистеин (ДНКЖ-Ацц). Известно,

лярными тиолсодержащими лигандами (глутати-

что данное соединение является нетоксичным и

оном, цистеином) могут быть сравнительно про-

широко используется как муколитическое сред-

сто синтезированы в лабораторных или промыш-

ство, которое легко проникает через клеточные

Сокращения: ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа,

мембраны. Можно предположить, что аналогич-

ДНКЖ-Глт

- динитрозильные комплексы железа с

ными свойствами будет обладать и ДНКЖ-Ацц.

глутатионом, ДНКЖ-Ацц - динитрозильные комплексы

Ранее нами уже было показано, что данные амфи-

железа с N-ацетил-L-цистеином, ЭПР - электронный

фильные комплексы и/или продукты их полурас-

парамагнитный резонанс, АД - артериальное давление,

пада проникают в организм в результате тран-

ЧСС - частота сердечных сокращений, Fe-DETC₂ -

сдермального [17] или ингаляционного [18] вве-

комплексы ионов железа и диэтилдитиокарбамата.

581

582

ТИМОШИН и др.

дения, и выступают как источники NO в органах

стрировали АДср. и ЧСС, причем как до, так и в

и тканях.

течение одного часа после введения ДНКЖ-Ацц.

Целью данной работы является анализ дей-

Далее в половине опытов животных забивали

ствия такой стабилизированной формы NO, как

передозировкой уретана, после чего у них забира-

ДНКЖ-Ацц, при сублингвальном введении дан-

ли образцы ткани органов (сердце, легкое, пе-

ного соединения в организм крыс.

чень, почка, скелетная (бедренная) мышца), а

также цельной крови. Полученные образцы по-

мещали в пластиковые трубки диаметром 5.0 мм,

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

которые сразу же замораживали, хранили в жид-

ком азоте и использовали для регистрации их

Синтез препарата ДНКЖ-Ацц проводили в ла-

спектров ЭПР.

бораторных условиях в соответствии с методи-

кой, описанной нами ранее [17]. Формирование

В других опытах в обеих экспериментальных

данных комплексов, как и ранее, контролирова-

группах методом ЭПР проводили исследование

ли методом электронного парамагнитного резо-

общего уровня NO в ткани органов. Для этого

нанса (ЭПР) [17]. Далее полученный водный рас-

применяли липофильные спиновые ловушки ок-

твор этого соединения замораживали, хранили в

сида азота, такие как комплексы ионов железа и

жидком азоте и размораживали непосредственно

диэтилдитиокарбамата (Fe-DETC₂), с регистра-

перед началом эксперимента. После разморажи-

цией образующихся спиновых аддуктов NO-Fe-

вания в него добавляли глицерин, конечная кон-

DETC₂ методом ЭПР. При этом животным через

центрация которого составляла 20%.

1 ч после сублингвального введения ДНКЖ-Ацц

Эксперименты проводили на нормотензивных

путем инъекций вводили компоненты этой спи-

крысах линии Wistar (самцы массой 350-450 г).

новой ловушки NO - диэтилдитиокарбамат (DE-

Животных содержали в биоклинике НМИЦ кар-

TC, 620 мг/(кг массы тела) в 1.0 мл физиологиче-

диологии Минздрава России в клетках по пять

ского раствора, внутрибрюшинно) и FeSO₄·7H₂O

особей со свободным доступом к сухим кормам и

с цитратом натрия (25 и 125 мг/(кг массы тела) со-

воде. Световой режим контролировался в режиме

ответственно в 1.0 мл физиологического раство-

12 ч : 12 ч (свет : темнота) при достаточной смене

ра, подкожно в область левого плеча). Далее через

объемов воздуха и температуре 19-23°С.

20 мин животных забивали и изолировали их

В начале опыта крыс анестезировали препара-

сердце, легкие, печень, почки и скелетную (бед-

том Золетил-100 (5 мг/кг массы тела). Далее для

ренную) мышцу. Эти органы сразу промывали в

регистрации среднего артериального давления

физиологическом растворе и измельчали механи-

(АД_ср) и частоты сердечных сокращений (ЧСС)

чески. Образцы размельченной ткани этих орга-

нов помещали в пластиковые трубки диаметром

животным в левую сонную артерию вводили по-

5.0 мм, которые сразу же замораживали, хранили

лиэтиленовый катетер РЕ-50, который подклю-

в жидком азоте и использовали для регистрации

чали к манометрическому датчику P23 Db (Gould

их спектров ЭПР.

Statham, США). Полученный сигнал АД через

усилитель «Biograph-4» (СПбГУ аэрокосмическо-

Спектры ЭПР синтезированных ДНКЖ-Ацц в

го приборостроения, Россия) подавали на АЦП

водной среде регистрировали при комнатной

NI-USB 6210 (National Instruments, США) и обра-

температуре в стеклянных капиллярах. Амплиту-

батывали на компьютере с помощью специаль-

да высокочастотной модуляции магнитного поля

ных программ записи и обработки сигналов фи-

составляла 0.4 мТл. При этом мощность сверхвы-

зиологических параметров работы сердца

сокочастотного поля спектрометра всегда уста-

(автор - Е.В. Лукошкова). Через тот же катетер

навливали на уровне 10 мВт при частоте 9.14 ГГц.

проводили забор образцов крови после введения

Сканирование магнитного поля, как и ранее (см.

животным препарата ДНКЖ-Ацц.

работу [17]), осуществляли с центром при g = 2.03.

Далее всех животных делили на две экспери-

Спектры ЭПР всех полученных образцов тка-

ментальные группы по пять-шесть особей в каж-

ни органов регистрировали на ЭПР-спектромет-

дой. Животные из первой группы получали

ре Х-диапазона Е-109Е (Varian, США) при темпе-

ДНКЖ-Ацц в глицерине путем сублингвального

ратуре жидкого азота. Амплитуда высокочастот-

введения. В этом случае данный препарат вводи-

ной модуляции магнитного поля составляла

ли в ротовую полость или в защечный мешок ка-

0.4 мТл (при исследовании образцов ткани орга-

нов и крови без Fe-DETC₂) или 0.2 мТл (при ре-

пельно с помощью инсулинового шприца с тупой

иглой в течение 35-40 мин. Общий объем препа-

гистрации сигналов спиновых аддуктов в ткани)

рата ДНКЖ-Ацц составлял 1.0 мл, а его доза была

при частоте 100 кГц. Мощность сверхвысокоча-

стандартной и составляла 5.0 мкмолей из расчета

стотного поля спектрометра устанавливали на

на одно животное. В другую группу входили кон-

уровне 10 мВт, его частота составляла 9.33 ГГц.

трольные животные, которым данный препарат

Сканирование магнитного поля при записи сиг-

не вводили. В ходе экспериментов у крыс реги-

налов ЭПР таких образцов осуществляли с цен-

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

ДЕЙСТВИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С ЛИГАНДОМ

583

Рис. 1. Спектр ЭПР синтезированных комплексов

ДНКЖ-Ацц в водном растворе при комнатной

температуре.

Рис. 2. Спектры ЭПР замороженных образцов ткани

органов и цельной крови крыс, полученных через 1 ч

тром при g = 2.03. После записи сигналов все об-

после сублингвального введения препарата ДНКЖ-

разцы размораживали и определяли массу ткани в

Ацц: 1 - сердце, 2 - легкое, 3 - печень, 4 - почка, 5 -

активной зоне резонатора спектрометра.

скелетная мышца, 6 - кровь. Температура - жидкий

Статистическую обработку данных и построе-

азот.

ние графиков проводили с использованием паке-

та программ Origin 8 (OriginLab Corporation,

норме, а уже начиная с 40-й минуты немного сни-

США). Все данные в статье представлены как

жалось, достигая 135 ± 7 мм рт. ст. на 50-й минуте

среднее значение ± ошибка среднего. Кратность

и 123 ± 10 мм рт. ст. на 60-й минуте эксперимента.

повторения опытов составляла не менее пяти-

ЧСС при этом повышалось до 426 ± 28 уд./мин.

шести экспериментов. Для проверки статистиче-

ской достоверности эффектов использовали дву-

Следовательно, в ходе опытов регистрирова-

сторонний t-критерий Стьюдента.

лись лишь небольшие изменения АД_ср и ЧСС, но

никаких достоверных изменений величин этих

параметров в результате введения ДНКЖ-Ацц не

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

обнаружено, таким образом, оно не оказывало за-

В ходе экспериментов в лабораторных услови-

метного влияния на общую гемодинамику орга-

ях проводили синтез препарата ДНКЖ-Ацц и ис-

низма. Вероятно, при таком способе введении

следовали его действие при сублингвальном вве-

препарата не происходит существенного увеличе-

дении в организм крыс. На рис. 1 представлен

ния уровня свободного NO и/или его стабилизи-

спектр ЭПР полученного соединения при ком-

рованных форм в кровотоке животного, из-за че-

натной температуре. Видно, что он представляет

го выраженный гипотензивный эффект также от-

собой асимметричный синглетный сигнал с цен-

сутствует. Вместе с тем нельзя исключить, что

тром при g = 2.03, характерный для данных соеди-

при сублингвальном введении ДНКЖ-Ацц его

нений и описанный ранее в работах многих авто-

перенос в организме в значительной степени осу-

ров [7, 8, 17].

ществляется лимфотоком [16, 17], а в кровотоке

содержание этих комплексов и/или вторичных

В другой части работы в ходе всего опыта про-

продуктов их распада невелико и недостаточно

водили мониторинг параметров АД_ср и ЧСС.

для инициирования заметного снижения средне-

Установлено, что в исходном состоянии (до вве-

го АД.

дения ДНКЖ-Ацц) АД_ср составляло 137 ± 6 мм

Кроме того, проводили анализ ткани органов и

рт. ст., а ЧСС - 394 ± 27 уд./мин. Через 5 мин по-

цельной крови методом ЭПР, при этом исследо-

сле начала закапывания данного препарата под

вались образцы, замороженные через 1 ч после

язык обычно наблюдали небольшой подъем АД_ср

сублингвального введения ДНКЖ-Ацц экспери-

(до 156 ± 8 мм рт. ст.), при этом ЧСС немного па-

ментальным животным. Характерные спектры

дала (до 378 ± 29 уд./мин). Через 10-15 мин от на-

ЭПР исследуемых образцов представлены на

чала введения ДНКЖ-Ацц АД_ср возвращалось к

рис. 2. Из этого рисунка видно, что в образцах

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

584

ТИМОШИН и др.

ткани регистрировались свободнорадикальные

сигналы (g = 2.00), которые представляют собой

суперпозицию спектров убисемихинона и флаво-

семихинонов [19].

Из рис. 2 также видно, что в спектре заморо-

женной ткани печени (сигнал 3) при g = 2.03 реги-

стрировалась компонента, соответствующая ДН-

КЖ с белковым тиолсодержащим лигандом, в то

время как на других спектрах на этом рисунке она

отсутствовала. При этом в контрольной группе

животных такие компоненты при g = 2.03 также

отсутствовали в образцах сердца, легких, почки и

скелетной мышцы, а в пробах ткани печени при

g = 2.03 наблюдали лишь очень слабый сигнал,

соответствующий базальным ДНКЖ с белковы-

ми лигандами (данные не приведены), который

был существенно меньше, чем наблюдаемый в

этом органе после сублингвального введения ДН-

КЖ-Ацц (спектр 3, см. рис. 2). Полученный ре-

зультат заставляет думать о том, что в результате

такого введения ДНКЖ-Ацц происходит превра-

Рис. 3. Спектры ЭПР замороженных образцов ткани

щение этих комплексов в ДНКЖ, связанные с

органов крыс, полученных через

20 мин после

белками, и накопление последних в ткани пече-

введения животным компонентов спиновой ловушки

Fe-DETC₂, т.е. через 1 ч 20 мин после введения

ни, в то время как в других исследуемых органах

препарата ДНКЖ-Ацц: 1 - сердце, 2 - легкое, 3 -

такие соединения не регистрируются.

печень,

- почка, 5 - скелетная мышца. Тем-

Из этого рисунка также видно, что после вве-

пература - жидкий азот.

дения ДНКЖ-Ацц в спектре крови сигнал при g =

2.03 отсутствовал, что может свидетельствовать

присутствовали узкие эквидистантные триплет-

об отсутствии регистрируемого количества пара-

ные сигналы, принадлежащие спиновым аддук-

магнитных ДНКЖ в кровотоке. Кроме того, в

там NO-Fe-DETC2 (g = 2.036). Содержание этих

этом случае не регистрировался сигнал от ком-

мононитрозильных комплексов, как отмечалось

плексов NO с железом гемовой группы гемогло-

бина (нитрозилHb) [3], что может указывать на

выше, отражает уровень NO, включая его депо-

отсутствие избытка свободного NO в кровотоке

нированные формы.

после введения ДНКЖ-Ацц.

Исходя из этих сигналов, оценивали содержа-

В другой части работы в обеих эксперимен-

ние NO-Fe-DETC₂ во всех образцах ткани как

тальных группах проводили оценку общего уров-

количество парамагнитных центров в образце с

ня NO с применением метода ЭПР и использова-

нормировкой на массу ткани в активной зоне ре-

нием спиновой ловушки Fe-DETC₂. Как извест-

зонатора спектрометра. Для оценки эффекта вво-

но [20], эта ловушка обладает гидрофобными

димого сублингвально ДНКЖ-Ацц на общий

свойствами и способна эффективно взаимодей-

уровень NO в ткани органов, на рис. 4 представ-

ствовать как со свободным NO, так и с его депо-

лены значения содержания NO-Fe-DETC₂, соот-

нированными формами, с образованием стабиль-

ветствующие животным, получавшим ДНКЖ-

ных парамагнитных спиновых аддуктов NO-Fe-

Ацц (параметр N+ДНКЖ-Ацц) с нормировкой на

DETC₂, регистрируемых методом ЭПР.

аналогичные параметры, соответствующие кон-

На рис. 3 представлены характерные спектры

трольной группе (N_контр). Из этого рисунка вид-

ЭПР образцов ткани исследуемых органов, полу-

но, что в результате действия ДНКЖ-Ацц во всех

ченных через 20 мин после введения компонен-

органах экспериментальных животных реги-

тов этой ловушки в организм. Из этого рисунка

стрировалось увеличение общего уровня NO.

видно, что в исследуемых образцах также реги-

стрировали свободнорадикальные сигналы ЭПР,

При этом для сердца и печени данные различия

а также компоненты, принадлежащие комплек-

являются достоверными, а наиболее существен-

сам молибдена в высокопольной части спектров.

ный эффект наблюдался для ткани печени живот-

Следует отметить, что во всех случаях в спектрах

ного.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

ДЕЙСТВИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С ЛИГАНДОМ

585

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все исследования были выполнены в соответ-

ствии с директивой 2010/63/eu Европейского

парламента и Совета Европейского союза от 22

сентября 2010 года по охране животных, исполь-

зуемых в научных целях, и принципами нацио-

нального стандарта ГОСТ Р 53434-2009.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Y.-J. Chen, W.-C. Ku, L.-T. Feng, et al., J. Am. Chem.

Soc. 130 (33), 10929 (2008).

C.-H. Ke, C.-H. Chen, M.-L. Tsai, et al., J. Am.

Chem. Soc. 139 (1), 67 (2017).

K. B. Shumaev, O. V. Kosmachevskaya, A. A. Ti-

moshin, et al., Methods Enzymol. 436, 445 (2008).

K. B. Shumaev, A. L. Dudylina, M. V. Ivanova, et al.,

Рис. 4. Значения содержания парамагнитных спино-

BioFactors 44 (3), 237 (2018).

вых аддуктов NO-Fe-DETC₂

в образцах ткани орга-

Y. Suryo Rahmanto, D. S. Kalinowski, D. J. Lane,

нов животных (параметр N+ДНКЖ-Ацц), получавших

et al., J. Biol. Chem. 287 (10), 6960 (2012).

препарат ДНКЖ-Ацц, с нормировкой на аналогич-

ные величины, соответствующие контрольным жи-

M.-L. Tsai, C.-C. Tsou, and W.-F. Liaw, Acc. Chem.

вотным (N_контр); * - р < 0.05 по сравнению с величи-

Res. 48, 1184 (2015).

ной данного отношения, равной единице.

A. F. Vanin, A. P. Poltorakov, V. D. Mikoyan, et al.,

Nitric Oxide: Biol. Chem. 23, 136 (2010).

Следует отметить, что полученные нами ре-

A. F. Vanin, Nitric Oxide: Biol. Chem. 54, 15 (2016).

зультаты согласуются с данными более ранней

S.-C. Wu, C.-Y. Lu, Y.-L. Chen, et al., Inorg. Chem.

работы [17], где было показано, что вводимые

55 (18), 9383 (2016).

крысам трансдермально ДНКЖ-Ацц приводили

10.

А. А. Тимошин, Д. Ю. Дроботова, О. В. Цки-

к незначительному снижению АД_ср, но вызывали

тишвили и др., Докл. РАН 432 (3), 416 (2010).

рост общего уровня NO в ткани легких и печени.

В то же время полученный эффект ДНКЖ-Ацц

11.

К. Б. Шумаев, А. А. Губкин, С. А. Губкина и др.,

существенно отличался от действия вводимого с

Биофизика 51 (3), 472 (2006).

помощью инъекций ДНКЖ-Глт, которые оказы-

12.

К. Б. Шумаев, О. В. Космачевская, Д. И. Грачев

вали выраженное гипотензивное действие [15,

и др., Биомед. химия 67 (2), 162 (2021).

16].

13.

K. B. Shumaev, A. A. Gubkin, V. A. Serezhenkov,

Таким образом, препарат ДНКЖ-Ацц, как

et al., Nitric Oxide: Biol. Chem. 18, 37 (2008).

стабилизированная форма NO, может осуществ-

14.

А. А. Тимошин, В. Л. Лакомкин, А. А. Абрамов

лять перенос NO в организм при его сублингваль-

и др., Биофизика 64 (1), 108 (2019).

ном введении. В результате его введения в ткани

печени регистрируется образование и накопле-

15.

A. A. Timoshin, V. L. Lakomkin, A. A. Abramov,

ние комплексов ДНКЖ с белковыми лигандами.

et al., Eur. J. Pharmacol. 765, 525 (2015).

Кроме того, в результате действия ДНКЖ-Ацц

16.

А. А. Тимошин, В. Л. Лакомкин, А. А. Абрамов и

регистрируется достоверное увеличение общего

др., Бюл. эксперим. биологии и медицины 162 (8),

уровня NO в ткани сердца и печени, причем наи-

169 (2016).

более существенный эффект установлен для пе-

чени животного.

17.

А. А. Тимошин, К. Б. Шумаев, В. Л. Лакомкин

и др., Бюл. эксперим. биологии и медицины 170

(9), 290 (2020).

БЛАГОДАРНОСТИ

18.

А. Ф. Ванин, А. В. Пекшев, А. Б. Вагапов и др.,

Авторы выражают

благодарность проф.

Биофизика 66 (1), 183 (2021).

А.Ф. Ванину за ценные советы.

19.

A. A. Timoshin, O. I. Pisarenko, V. L. Lakomkin, et

al., Exp. Clin. Cardiol. 5 (2), 59 (2000).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

20.

A. F. Vanin and A. A. Timoshin, In Methods in Molec-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

ular Biology (Humana Press, New York,

2011),

интересов.

Vol. 704, pp. 135-149.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022